[发明专利]一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法。

背景技术

走马胎（ArdisiagigantifoliaStapf）又名大叶紫金牛、走马风、豆收，为紫金牛科紫金牛属植物。全株药用，民间有“两脚行不开，不离走马胎”之说，具有活血化瘀、祛风湿、壮筋骨、止血生肌等功效，治疗风湿筋骨疼痛、跌打损伤、产后血瘀、痈疽溃疡等症。近年来，随着对走马胎化学成分和药理研究的不断深入，还含有显著的抗恶性肿瘤、抗血栓、抗炎、抗氧化等疗效的生物活性成分。走马胎的药用价值不断被挖掘，应用也越来越广，市场需求量不断增加。

走马胎为常绿小灌木，根茎粗壮，主要分布在广西、广东、江西等地，多生于海拔1300m以下的山谷、溪旁的疏、密林下潮湿处。目前，走马胎药材主要来源于野生资源，需要生长三年以上，周期长，且产量不高。在走马胎野生分布区，药农长期的采而不种，造成野生自然资源过度采挖，使得走马胎分布点越来越少，资源日渐匮乏。

随着走马胎供需矛盾日益尖锐，人工栽培势在必行。然而苗木供应紧张制约了走马胎的人工栽培。目前，走马胎的繁殖方式为扦插繁殖和种子繁殖，都难以提供大量种苗。主要由于以下两方面的原因：扦插繁殖存在母本数量少和繁殖系数低等问题；而种子繁殖则存在野生资源分散、成熟时间不一致造成种子采集困难等问题，且种子萌芽需要的时间长。植物组织培养具有不受时间和地点限制、繁殖系数高、可保持母本优良性状等特点，在植物种苗繁育上广泛应用。在走马胎组织培养研究过程中，由于走马胎为木本植物，取嫩芽为外植体时存在灭菌难等问题，而通过灭菌的种子在培养基上萌芽获得无菌植株，以其芽繁殖芽进行丛生芽诱导，存在增殖系数低、继代时间长等问题，造成培养成本高，严重阻碍了走马胎组培苗在人工栽培中的应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，而提供一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法，通过走马胎愈伤组织诱导、分化成芽来提高走马胎出芽数量，该方法操作简单、稳定高效，并能大大降低组培苗的培养成本。

实现本发明目的的技术方案是：

一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法，包括以下步骤：

（1）在超净工作台上，将走马胎种子用75%乙醇溶液灭菌1min，无菌水清洗1次，再用0.1%升汞（HgCL₂)溶液灭菌10min，无菌水清洗5次，放到灭菌过的滤纸上吸干水分，接入MS培养基上培养30～50d，种子萌芽，得到无菌植株；将无菌植株的茎段和芽接入愈伤组织诱导培养基上培养35～45d，诱导率为100%；

所述愈伤组织诱导培养基为：MS+2,4-D0.5mg/L+6-BA0.1mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8；

(2)在超净工作台上，将走马胎的茎段和芽诱导得到愈伤组织切分成0.2cm×0.2cm小块，接入增殖培养基中培养30d，增殖系数为3.7～6.2；

所述增殖培养基为：MS+2,4-D0.5～2.0mg/L+6-BA0.1～0.5mg/L+TDZ0.5～2.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8；

（3）在超净工作台上，取出步骤（2）中得到的愈伤组织切分成0.5cm×0.5cm小块，接入分化培养基中培养30d，分化率为100%，分化系数为4.2～13.7；

所述分化培养基为：MS+ZT0.5～3.0mg/L+IBA0.1～0.5mg/L+TDZ0.5～2.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8；

（4）将步骤（3）中得到的芽切分成单芽，接入壮芽培养基中培养30～40d，芽长到2～5cm；

所述壮芽培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8；

（5）将步骤（4）中得到的壮芽的基部切掉，接入生根培养基中培养45～55d，得到走马胎组培苗；

所述生根培养基为1/2MS+NAA2.0mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L，pH值为5.8。

所述愈伤组织诱导、增殖培养、分化培养、壮芽培养及生根培养阶段的培养条件是：培养温度为25±3℃,光照时间为12h/d，光照强度为2000Lx。

所述培养基中，2,4-D为2,4-二氯苯氧乙酸，6-BA为苄氨基嘌呤，TDZ为噻重氮苯基脲，ZT为玉米素，IBA为吲哚-3-丁酸，NAA为a-萘乙酸，试剂均为分析纯，水为超纯水。