[发明专利]用于空间解析荧光相关光谱学的光垫显微镜

说明书

一种用于空间解析荧光相关光谱学的光垫显微镜。本公开内容教导了显微镜(1)，其具有用于照明样品或物体(18)的照明光路(20)和用于观察所述样品的观察光路(40,50)，所述显微镜包括在照明光路中的照明光路聚焦装置，所述照明光路聚焦装置限定沿着所述照明光路的照明方向和其垂直方向延伸的基本上二维的样品或物体照明区域(22)。所述显微镜进一步包括在照明光路中的用于有选择地照明所述基本上二维的物体照明区域的部分(10)的照明区域界定装置(27)，其中所述基本上二维的物体照明区域的该部分在所述照明方向和其垂直方向中的至少一个方向上被界定。

本申请是申请号为201280008835.0的申请的分案申请。

原申请的申请日：2012年02月14日

原申请的申请号：201280008835.0

原申请的发明名称：用于空间解析荧光相关光谱学的光垫显微镜

技术领域

本发明涉及光学显微镜，特别是涉及具有限定的焦体(focal volume)的光学显微镜，以及适合于样品浓度波动测定的方法。

背景技术

扩散从根本上有助于可溶性分子的运动，从而从根本上有助于从细胞分裂和细胞内部的信号转导的调节到组织起源时的激素调节以及到发育过程中的形态发生原梯度等许多生物进程的时空方面。在复杂的细胞环境中量化生物分子的扩散性质是非常有挑战性的。能够直接分析扩散过程的装置和方法是非常少的且都是为个别问题专门定制的。

确定生物分子特别是蛋白质的且特别是在它们的自然环境中的性质和行为，是说明和分析它们的功能和在细胞过程和发育过程背后的机理的关键步骤。荧光相关光谱学(FCS)[1,2]是已知的用于分析分子迁移率的方法，分子迁移率提供了关于标记分子的移动的和不动的部分、它们的扩散性质和浓度、以及相互作用的不同标记分子的共扩散的信息。

共焦激光扫描显微镜(共焦显微镜)是目前选择用于具有高分辨率的活细胞成像[3]和用于FCS的仪器，因为共焦激光扫描显微镜与利用雪崩光电二极管(APD)的超敏光子计数结合使衍射极限成像(diffraction limited imaging)成为可能。利用共焦激光扫描显微镜的FCS测定已经被应用于量化发信号时涉及的蛋白质复合物形成的动力学(由EMBL作出的[4]和由其他人作出的[5])，以研究具有出口能力(export-competent)的mRNP的成熟[6,7]或表征形态发生原梯度[8]。利用共焦激光扫描显微镜的FCS测定在本公开内容中被称为共焦FCS。然而，由于共焦FCS数据采集的一个点接着另一个点的连续做法所施加的内在局限性，连同因失焦的光照而导致的输入到样本中的光子的总荧光光子产率过低，使得共焦FCS实验仍然具有挑战性[9]。通常，共焦激光扫描显微镜仅允许在特定的所选的位置上测定每个细胞的一个或少数几个点[4,10,11]。

换而言之，共焦FCS没有提供足够的空间解析信息以产生原本能够将跨越整个细胞或生物体的分散过程和其它来自FCS的蛋白质参数(例如蛋白质相互作用)视觉化的细胞和其它生物样品的图像。

已知方法和装置的另一个缺点是扩散的空间解析成像是有限的或不可能的。

发明内容

本公开内容教导了具有用于照明样品或物体的照明光路和用于观察样品的观察光路的显微镜。所述显微镜包括在所述照明光路中的照明光路聚焦装置，所述照明光路聚焦装置限定基本上为二维的样品或物体照明区域，所述照明区域沿着所述照明光路的照明方向和其垂直方向延伸。所述二维物体或样品照明区域可以被视为光带或光片(light-sheet)。由于照明光被成形为所述二维样品照明区域，因此所述照明光路聚焦装置可以被理解为光路成形装置。