[发明专利]一种可用于低海拔地区之全人工培育冬虫夏草的方法

权利要求书

1.一种可用于低海拔地区之全人工培育冬虫夏草的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)菌种准备：

挑选完整新鲜野生虫草，用无菌水冲洗过夜后，在洁净工作台剥开虫体部分，勾取里面菌丝培养，依生长情况，培养90-120天后，低温、光照的条件在培养基斜面上长出子实体，选择符合要求的子实体进行纯化扩培，经分子鉴定确定为菌种无误后进行生产发酵扩大；

(2)寄主工程：

1)在野外采集的第一代虫蝙蝠蛾蛹用滤纸保湿培养，羽化为成虫后，经形态鉴定其物种，成虫安排在羽化帐中，羽化帐底部铺腊纸，在蜡纸上放入树枝，以便成虫攀附产卵；产卵后将卵收集，将其放入培养箱中培养，其中采用常规滤纸保湿方法保持卵的湿度，培养温度为12-15℃，培养时间为28-40天；培养结束后用无菌水冲洗干净；

2)待卵孵化后模拟高山草甸环境饲养幼虫，养虫的基质层以草炭土、泥炭土、沙土、蛭石为主，含水量35-40％；基质层用于模拟高山环境用腐殖土；用于养虫的外部环境为低温高湿环境，温度约为14℃，空间湿度约为50％，卵期和蛹期及成虫饲养空间湿度为90％；每个养虫盒饲养100条虫；

(3)世代循环：

按上述方式饲养后的第二年的3-6月翻开基质，可发现第二代蛹，按雌雄分开饲养，饲养基质层与在前的基质层相同，方便以后进行雌雄配比羽化交尾，养蛹湿度比养虫的湿度大，为60％，空间湿度每天用造雾器喷2次水雾，保持土壤和空间湿度，进行二代虫的饲养，依此方法可进行世代循环；

(4)侵染工程：

采用下述方法中的任意一种：

方法一：用第一步分离确定之菌种进行常规发酵培养，用得到菌丝用300目滤网过滤，将滤网上的菌丝倒在5％的葡萄糖溶液中，用打碎机捣碎，再用100目过滤网过滤，保留滤液作为侵染液，此时的侵染液中含有液体发酵的孢子和菌丝段，拌入养虫基质层第三层沙土层中，利用幼虫食入肠道或者接触表皮气孔达到侵染的目的；

方法二：利用人工培养冬虫夏草用针刺侵染装置进行针刺侵染，所述进行针刺侵染针筒的外侧壁上设有针头容纳盒，针筒的头部设有针头，针头上包裹硅胶垫，针头露出硅胶垫的长度为1.3-1.6mm，针头的直径为0.15-0.3mm；用发酵液颜色为棕黄色或者黄黑色的发酵菌丝经过300目滤网或者miracloth过滤、将滤网上的菌丝倒在5％的葡萄糖溶液中，用打碎机捣碎，再用两层纱布过滤，收集滤液用低温离心机在4℃下离心30分钟，离心机转速为10000转/分钟；离心后发现离心管底部为菌丝饼状或团状，最上面一层为几乎是纯水，用针头抽取菌丝饼或团之上、纯水层之下的中间层液体，作为针刺侵染液；采用手动的方法，针刺蝙蝠蛾幼虫，针刺时的深度把握，以硅胶垫的头部轻触为准；

(5)人工培养出草：

侵染后幼虫在第二年2月以后会陆续出现僵死虫，翻开基质收集僵虫，表面用75％酒精快速消毒，编号后栽在与除开饲料层养虫环境相同的基质中，湿度约为50％，放在培养箱中，模拟高山环境，昼夜变温，其中采用日光灯照射8-9小时，温度控制在15℃-17℃之间，晚上温度控制在3℃-4℃之间，无日光灯照射，时间为15-16小时，待有微微出草时，每天中午采用波长275-420nm的紫外线照射处理10分钟，培养直至出草到适当高度后取出，即得人工培养的冬虫夏草。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌种为中国科学院微生物研究所鉴定编号为(2015)微检字第032号的菌种，所述菌种编号为KD₂B₂01的中国被毛孢菌株，且能经过经低温、光照条件在培养基斜面上长出子实体的菌株。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基质层的第一层为以草炭土和泥炭土腐殖质较高的腐殖质层，第二层为饲料层，第三层以沙土为主，最下层以蛭石为主；将湿度调节好的各层基质分别放置3个月，此时基质微生物环境稳定，再配制基质层用于幼虫饲养，所述基质层铺设厚度为2-10cm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中日光灯光照强度为8000lx。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，幼虫的饲料为珠芽蓼、圆穗蓼、胡萝卜和甘露子的混合饲料。