[发明专利]一种酶活提高的L-天冬酰胺酶突变体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶活提高的L-天冬酰胺酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

L-天冬酰胺酶(L-asparaginaseamidohydrolase，E.C.3.5.1.1)能够将L-天冬酰胺水解脱氨基形成L-天冬氨酸和氨。L-天冬酰胺酶具有抗肿瘤活性，目前已应用于治疗急性淋巴细胞白血病及霍金森病等，近年来研究发现L-天冬酰胺酶还可以减少油炸食品中丙烯酰胺的生成。L-天冬酰胺酶大小、结构及性质因来源不同而有所不同。L-天冬酰胺酶来源比较广泛，豚鼠血清、植物以及微生物中都发现含有L-天冬酰胺酶。

异源表达L-天冬酰胺酶突出的问题是，蛋白表达量低、L-天冬酰胺酶酶活低。因此，定点突变改造L-天冬酰胺酶，提高胞外酶活，对于提高L-天冬酰胺酶工业化应用前景具有重要意义。

发明内容

本发明首先提供了一种酶活提高的L-天冬酰胺酶突变体，其氨基酸序列是SEQIDNO.1所示的序列。

编码所述突变体的核苷酸序列是SEQIDNO.3所示的序列。

所述突变体是在氨基酸如序列SEQIDNO.2所示的氨基酸的基础上，将107位氨基酸由甘氨酸突变成天冬氨酸。

本发明还提供了一种表达所述L-天冬酰胺酶突变体的基因工程菌。

所述基因工程菌的制备方法，是在SEQIDNO.4所示核苷酸序列的基础上，将编码第107位的甘氨酸的密码子突变成了编码天冬氨酸的密码子，得到重组基因，将重组基因连接到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到枯草芽孢杆菌宿主菌中即得到枯草芽孢杆菌基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体是pMA5。

在本发明的一种实施方式中，所述的制备方法，具体是：

(1)以SEQIDNO.4所示核苷酸序列为模板，Flprimer(序列如SEQIDNO.5所示)，Rlprimer(序列如SEQIDNO.6所示)为引物，进行PCR即得到SEQIDNO.3所示的重组基因G107D。

(2)将上一步得到的重组基因序列，连接到pMA5表达载体中，得到重组质粒pMA5-G107D，重组质粒化转化B.subtilis168，获得重组枯草芽孢杆菌工程菌株，命名为pMA5-G107D/B.subtilis168。

本发明在天然L-天冬酰胺酶的基础上，通过定点突变生物技术改造L-天冬酰胺酶分子结构，突变体酶的纯酶液比酶活较突变前提高83％。突变体酶G107D的底物亲和力K_m较突变前降低50％，而催化效率提高(k_cat与K_m的比值)84％。本发明表明107位氨基酸残基对酶的催化作用有较大影响，对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了该酶的工业应用潜力。本发明所得可用于制备治疗急性淋巴细胞白血病及霍金森病的药物，也可用于减少油炸食品中丙烯酰胺的生成。

具体实施方式

实施例1含L-天冬酰胺酶突变体的重组载体的构建

(1)G107D突变体的获得：以SEQIDNO.4所示核苷酸序列为模板，Fprimer(序列如SEQIDNO.5所示)、Rprimer(序列如SEQIDNO.6所示)为引物，进行PCR即得到SEQIDNO.3所示的重组基因。

(2)将重组基因与pMA5分别用BamHI、MluI双酶切，纯化后用T4DNA连接酶16℃过夜连接。连接产物化学法转化JM109感受态细胞。转化液涂布含卡那霉素(50mg/L)LB平板，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，命名为pMA5-G107D。测序工作由上海生工完成。

实施例2产L-天冬酰胺酶枯草芽孢杆菌工程菌构建

将实施例1得到的重组质粒pMA5-G107D化学法转化入B.subtilis168感受态细胞，具体方法如下：

(1)转化实验所需溶液如下(g/L)：

Sp-A：(NH₄)₂SO₄4，K₂HPO₄28，柠檬酸钠12Sp-B：MgSO₄·7H₂O0.4