[发明专利]鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的引物、探针组合物、试剂盒及多重荧光PCR检测方法

权利要求书

1.鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的引物、探针组合物，其特征在于：包括以下引物和探针，其核苷酸序列如下：

（1）引物

通用引物：上游引物:5'AGACGAGAAGACCCTATGGAG3'；

下游引物:5'CTCCGAGGTCACCCCAA3'；

（2）探针：

驴特异探针(LP)：5’CACAAAAAATAATATACAAACCTAACCTCCAG3’；

马特异探针(MP)：5’CAACACACAAACCTAACCTTCAGGGA3’；

牛特异探针(NP)：5’CCAACCCAAAGAGAATAAATTTAACCATTA3’；

内标探针(16sP)：5'AAGTACGCTCCATTGGTGACCTCATTTC3'；

其中，所有探针的5’端修饰有荧光报告基团，所述荧光报告基团采用5种发光基团为FAM，JOE，CY3，CY5，ROX中的任意4种不同发光基团分别对各个探针的5’端进行荧光修饰，所有探针的3’端修饰有淬灭基团，可以为TAMRA、BHQ1或BHQ2中的一种或两种。

2.根据权利要求1所述的鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的引物、探针组合物，其特征在于：驴特异探针(LP)用FAM标记，马特异探针(MP)用CY3标记，牛特异探针(NP)用JOE标记，内参探针(16sP)用ROX标记；所有探针的3’端的淬灭基团用BHQ1修饰。

3.一种鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1或2所述引物、探针组合物，以及PCR反应所必需的反应原料和试剂。

4.根据权利要求2所述的鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的试剂盒，其特征在于：还包括内标，所述内标核苷酸序列如下：

AGACGAGAAGACCCTATGGAGTACAGCACGCCGTAAGCTTAACCTGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATTGGTGACCTCATTTTTTAGGTTTGGGGTGACCTCGGAG。

5.根据权利要求4所述的鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的试剂盒，其特征在于：所述内标以重组质粒的形式存在，所述重组质粒为将内标片段连接到PMD18-T载体上形成。

6.根据权利要求3所述的鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的试剂盒，其特征在于：所述PCR反应所必需的反应原料和试剂包括：PCR缓冲液，MgCL₂、dNTPs，Taq酶和超纯水；

所述试剂盒中各组分构成一个20μl的反应体系，pH值为8.9，镁离子终浓度为2.5mM，4种dNTP的终浓度各为250μM，Taq酶的用量为1U/反应，各引物、探针的终浓度均为0.4-1μM，及1pg/μL的内标DNA。

7.权利要求1或2所述的鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的引物、探针组合物在鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分中的应用。

8.权利要求3～6中任一项所述的鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的试剂盒在鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分中的应用。

9.一种鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的多重荧光PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：取待检测样品，提取DNA，然后利用权利要求1或2中所述的鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的引物、探针组合物，或权利要求3～5中任一项所述的鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的试剂盒对DNA进行PCR扩增，收集荧光信号，进行如下判断：

a.当相应的修饰驴、马、牛特异探针的报告基团荧光信号检出时，且Ct值<35，无论内标的荧光信号是否被检出，均判定为检出相应的驴、马、牛源成分；

b.当内标的荧光信号被检出，相应的修饰驴、马、牛特异探针的报告基团荧光信号未检出，或Ct值>35时，判定为不含有相应的驴、马、牛源成分或含量低于检测界限；

c.未有任何报告基团荧光信号检出，则实验失败，需要重新实验。

10.根据权利要求9所述的鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的多重荧光PCR检测方法，其特征在于：所述PCR扩增程序为：95℃10min预变性，95℃10s，58℃35s，在此收集荧光信号，共计45个循环。