[发明专利]一种利用细胞分泌蛋白SERS光谱检测药物细胞毒性方法

说明书

技术领域

本发明属于抗癌药物对细胞毒性的检测领域，具体涉及一种利用细胞分泌蛋白SERS光谱检测药物细胞毒性方法。

背景技术

分泌蛋白（secreted proteins）是指由细胞分泌到细胞外基质并通过体液循环作用于靶细胞和靶器官的可溶性的蛋白。细胞分泌蛋白质是一种重要的生物大分子，主要包括细胞因子、免疫调节因子、激素和其他生物活性分子，它们参与许多重要的生命过程，如：细胞信号的传导、细胞的增殖和分化、免疫防御等。尤其是肿瘤细胞的分泌蛋白，与恶性肿瘤的血管发生、分化、侵袭和转移密切相关，不同时期的肿瘤细胞可以产生各种分泌蛋白，主要作用包括增加血管通透性和纤维及纤连素外渗、调节机制金属蛋白酶、调节白细胞浸润、改变宿主免疫反应、促进血管新生等，最终促进肿瘤生长、浸润和转移。

拉曼散射效应是入射光照射到样品上时发生的频率和方向均改变的非弹性散射。拉曼光谱反映了样品分子化学键的振动信息，可用于分子结构的分析。它可以提供生物分子如蛋白质、核酸和脂质等成分和构象的化学指纹信息，具有样品预处理简单和检测无损等优点。然而常规拉曼散射信号较弱，易受样品荧光背景干扰，尤其对微量浓度的样品进行检测分析时，其灵敏度较低。表面增强拉曼光谱(Surface-enhanced Raman spectroscopy，简称SERS)技术借助增强基底的金属纳米尺度效应可显著增强吸附在金属纳米粒子表面待测分子的拉曼信号，最高达10¹⁴倍。SERS技术具有检测功率低、检测速度快、对生物样品损伤小、高灵敏度和高特异性等优点，是一种高效快速的单分子检测技术。

目前抗癌药物杀伤肿瘤细胞主要通过以下三类途径：（1）选择性阻断肿瘤细胞自分泌或旁分泌的信号传导通路，破坏其自控性生长调节机制；（2）抑制肿瘤组织血管生成；（3）诱导肿瘤细胞发生凋亡。在抗癌药物杀伤肿瘤细胞的过程中，其分泌蛋白的种类和数量均发生不同程度的变化。细胞分泌蛋白的变化情况很大程度上能反映出抗肿瘤药物的细胞毒性。

目前用于分泌蛋白检测和鉴定的传统方法主要是生物学方法，如多重聚合酶链反应（PCR）、免疫组化如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹法（western blotting）等，然而这些传统的方法存在步骤复杂、耗时长和成本较高等缺点。而且以上方法不能实现药物对细胞毒性的检测。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种利用细胞分泌蛋白SERS光谱检测药物对细胞毒性的方法。该方法具有步骤简单、检测快速和成本低廉等优点，可很大程度上克服传统细胞分泌蛋白检测方法的缺点并能实现药物对细胞毒性的检测。从而对研制生物活性高、毒性低的新型抗癌药物具有重要应用价值

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种利用细胞分泌蛋白SERS光谱检测药物对细胞毒性的方法，先利用乙醇富集经药物作用后的细胞分泌蛋白，再利用SERS光谱技术获取细胞分泌蛋白的SERS光谱，最后结合四唑盐比色法建立细胞分泌蛋白SERS光谱特征峰与细胞存活率标准曲线，从标准曲线中获得不同时间细胞存活率的定量信息，实现SERS光谱对药物细胞毒性的检测。

所述的利用细胞分泌蛋白SERS光谱检测药物对细胞毒性的方法，具体包括以下步骤：

1）细胞分泌蛋白的富集

待体外培养细胞处于对数分裂期时，弃掉原有细胞培养液，用PBS缓冲液冲洗三次，加入含有抗癌药物但不含双抗和胎牛血清的不完全细胞培养液，培养1-72h，分别取不同培养时间的细胞培养液200~500μL与-20℃~0℃的400-1000μL无水乙醇混合于一离心管中，8000~12000 rpm离心5-10min，弃上清液；沉淀用95wt%的乙醇洗涤一次，10000rpm离心2-5 min，弃上清液，得到沉淀于离心管底部的细胞分泌蛋白，室温下干燥30-60min；然后加入10~20μL超纯水溶解干燥后的细胞分泌蛋白，得到细胞分泌蛋白液；

2）SERS光谱检测

将SERS光谱增强基底溶胶进行离心浓缩处理，取SERS光谱增强基底浓缩胶体10-40μL与步骤（1）制得的细胞分泌蛋白液2-10 μL混合均匀后，在光滑平整的检测基底上点样，点样直径为5-8 mm，自然晾干后进行SERS光谱的测量；

3）细胞分泌蛋白SERS光谱预处理及特征峰选择