[发明专利]一种基于核酸外切酶的microRNA多色检测探针及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和核酸化学领域，涉及一种基于核酸外切酶的microRNA多色检测探针及检测方法。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是近年来在多种真核生物细胞中发现的一类来源于内源性染色体上的非编码单链RNA，长度约为20-24个核苷酸的短序列。MicroRNA是以单个基因或基因簇的形式分布在基因组上，大多数microRNA基因在RNA聚合酶II的作用下形成初级转录本(pri-miRNA)，pri-miRNA长度约为300-1000个碱基，pri-miRNA需要经过二次剪切才能形成成熟的microRNA，首先在细胞核内pri-miRNA被Dorsha酶剪切，形成约70个碱基的microRNA前体，即pre-miRNA；然后，pre-miRNA由转运蛋白Exportin-5运输到细胞质中，再次经Dicer酶识别并剪切，形成成熟microRNA。成熟microRNA结合到RNA诱导的沉默复合体中，介导转录后基因表达沉默或者抑制基因表达。

MicroRNA的生物学特性主要表现为：高度保守性，时序性和组织特异性。microRNA不仅在结构上保守，而且在物种间具有高度的进化保守性。细胞特异性和组织特异性是microRNA表达的主要特点。成熟的microRNA，5′端为磷酸基团，3′端为羟基，这一特点使它与大多数寡核苷酸和功能RNA的降解片段区别开来。

目前已发现1000种以上microRNA，科学家提出在生物的整个发育过程中microRNA可能调节细胞早期发育，参与细胞分化和组织发育，最为人们关注的是调控基因的表达。下游靶基因是发现microRNA调控基因表达的最直接手段，已有研究证明Lin-4、Let-7的靶基因是ras信号通路(SignalingPathway)的蛋白；Lin-41、hbl-1、Lin-14和lin-28调控时序发育；miR-375在哺乳动物中的靶基因为Mtpn对胰岛素分泌进行调节。这些结果证实，多个microRNA可协同作用于同一个靶基因的表达，同时单个microRNA可以作用于多个靶基因的翻译，因此同时对多种microRNA的检测显得非常必要。此外，研究发现，肿瘤细胞和正常细胞的microRNA表达谱具有明显的差异，且多数microRNA位于与肿瘤形成相关性脆弱基因位点，因此推测microRNA与肿瘤形成密切相关，并且在癌症的发生发展过程中扮演重要的角色，可能作为抑癌基因或者致癌基因。相关研究发现位于染色体13q14区段的miRNA-15和miRNA-16的局部丢失与慢性淋巴性白血病相关，首次证明了microRNA的失调与肿瘤之间有着密切的关系。另外，miRNA-21位于染色体17q23.2上的空泡膜蛋白基因的3'UTR区，该区域经常发现在乳腺癌、肺癌、结肠癌和神经细胞瘤中表达增强，研究表明与正常的乳腺组织相比，miRNA-21在乳腺癌组织中高表达，并且发现anti-miRNA-21介导的细胞生长的抑制与细胞凋亡的增加和细胞增殖的降低相关，研究结果表明，miRNA-21作为癌基因通过对Bc12的调节来调控肿瘤的发生，并且可以作为治疗和诊断的靶点。对肿瘤特定microRNA表达水平的研究和序列分析不仅有利于阐明肿瘤的发生发展机制，更为肿瘤的诊断、治疗和预后提供了新的方向和策略。

随着对microRNA功能的深入研究，MicroRNA日益成为一种非常重要的肿瘤和疾病的标志物，对其检测成为科学家们研究的热点。目前检测microRNA的方法如northernblot方法、RT-PCR的方法和芯片的方法，这些方法耗时长，需要昂贵的仪器，资源成本和经济成本都较高，还有一类基于电化学和纳米颗粒的检测方法，这些方法需要前期制备电极或者纳米颗粒，耗时耗力。因此发展一种简单、快速、低成本、并且能达到同时检测多种microRNA的新方法显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于核酸外切酶的microRNA多色检测探针以及检测方法。本发明能够实现高灵敏低成本快速简单同时检测多种microRNAs。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于核酸外切酶的microRNA多色检测探针，为发卡结构的DNA，包含三个部分：茎末端区、loop环状区和5'、3'末端标记的荧光基团和相对应的淬灭基团；所述的loop环状区包含待测microRNA的互补序列以及在该互补序列5'和/或3'方向的小段单链序列，本发明中的小段长度是相对microRNA序列长度而言，长度为10个碱基以下为小段。