[发明专利]用于分析核酸扩增反应的分析方法和系统

说明书

本发明涉及一种以在较宽范围的分析物浓度里改善通过实时核酸扩增反应RNR(诸如聚合酶链式反应PCR)量化的线性(精确性和/或准确性)和/或限制存在干扰性物质的效应为目的的分析方法，其通过以与增长曲线与包含至少两个不同阈值水平的在RNR循环范围里的组合阈值函数(CTF)的交叉对应的循环数目测定RNR的量化循环数目(Cq)进行，所述量化循环数目(Cq)指示增长曲线的定量和/或定性分析结果，所述增长曲线指示RNR循环范围里对于RNR的每个扩增反应循环，分析物的荧光发射强度。

发明领域

本发明涉及用于实时核酸扩增反应RNR(诸如聚合酶链式反应PCR)的分析方法和用于分析分析物的核酸扩增反应(诸如用于通过核酸扩增反应在样品中检测分析物的存在和/或测量分析物的量)的系统。

发明背景

体外核酸扩增技术包括许多基于不同办法的方法。一种办法包括倍增DNA或RNA序列，如此使得它对于各种规程或测试可更容易检出的方法。例如，可以使用下列一种方法完成核酸的体外扩增：聚合酶链式反应PCR、连接酶链式反应(LCR)、或等温转录介导的扩增(TMA)方法。在所有上文提及的办法中，核酸经受重复扩增循环。

一种经常用于各种医学、生物学或工业应用的技术是PCR技术。此技术依赖于热循环，包括用于核酸的酶促复制的重复加热和冷却的循环以扩增核酸链的特定区域。随着PCR进展，生成的DNA自身用作复制的模板，从而启动链式反应，其中DNA模板被指数扩增，随每个反应循环加倍(至少在理论上)。

核酸扩增技术包括许多变型。这些变型之一称作实时核酸RNR，并且基于扩增样品中的核酸并同时检测其存在以及另外为了量化其在样品中的浓度。

定量核酸扩增中有几种已知的用于检测产物的方法。根据这些方法之一，为了间接测量RNR期间的核酸量，获得分析物的荧光发射强度，并且创建增长曲线(growthcurve)，所述增长曲线指示RNR循环范围里的荧光发射强度。使用高于最初固定基线(initially stationary baseline)的增长曲线信号增加来测定每个反应中的量化循环Cq(quantification cycle Cq)。

使用各种CT法基于增长曲线测定量化循环Cq是多项发明申请的主题：

EP 2719770 A1披露了一种通过PCR及相应的分析仪在样品中检测分析物的存在和/或测量分析物的数量(quantity)的方法。特别地，披露了考虑信号的最大增长数值的增长曲线信号标准化。

US7788039B2披露了一种用于测定样品中的靶核酸量的方法。使用初始量的标准品、靶物和标准品增长曲线数值根据校准等式计算靶物的初始量，其中校准等式是非线性等式。

EP1798652B1披露了一种用于从测量数据创建增长信号的数学算法。

EP1798542A1显示了一种用于测定样品中的核酸存在的方法，其中根据增长信号选择数字值，并且通过比较选择的数字值与校准的数字值测定核酸的存在。

“Analyzing real-time PCR data by the comparative C_T method”,Thomas DSchmittgen等,Nature Protocols 3,-1101-1108(2008)提供了用于定量基因表达研究的比较C_T法的概述。

核酸扩增系统是从各个厂家商业上可购得的，其基于各种核酸扩增法并且用于医学应用，诸如检测传染病。因此，核酸扩增法的可靠性和精确性是最有意义的。

因此，本发明的实施方案旨在提供使用核酸扩增和相应系统的改善的分析方法，其实现核酸扩增分析的改善的稳健性(robustness)、精确性、准确性、线性和定性辨别力(discrimination)。

发明概述