[发明专利]蛋白质固相烷基化试剂的制备及固相烷基化试剂和应用

说明书

本发明涉及一种蛋白质固相烷基化试剂及其制备和应用，以硅胶颗粒为载体，通过原子自由转移聚合在载体表面上修饰环氧基团，然后通过共价键合方式依此修饰树枝状亲水性化合物聚乙烯亚胺和碘乙酸‑N‑琥珀酰胺酯，制备成固相烷基化试剂。该试剂可选择性与蛋白质上的巯基反应，具有稳定性高，操作简单、反应快速等优点。与传统的烷基化试剂相比，采用该试剂，蛋白质可与其它小分子(如糖、盐、表面活性剂、脂类等)实现快速分离，提高蛋白质的纯度，显著降低样本复杂程度。由于试剂表面亲水性较好，可显著提高蛋白质或酶解产物的回收率，因此，该试剂适合于细胞、组织、体液、毛发等提取蛋白质中巯基的选择性反应及预处理。

技术领域

本发明涉及一种蛋白质固相烷基化试剂，可应用于细胞、组织、体液、毛发等提取蛋白质中巯基的选择性反应及预处理。

背景技术

在临床上，为了对肿瘤进行确诊，通常需要对病人进行穿刺获得组织样本，切片后再通过电子显微镜进行病理诊断，这种方法不仅耗时长(1-4天)，而且存在假阳性的风险。利用分子分型方法对组织形态进行分类已经引起广泛的兴趣，目前主要是通过mRNA转录表达谱或代谢组学方法。最近，Ruedi课题组结合压力循环技术和SWATH技术发展了一种快速的、可重复性分析微量组织样本的蛋白质组分析方法，采用该方法分析9个肾癌病人的18种活体组织样本，可重复定量2000多种蛋白质，通过对获得定量信息的蛋白质进行分类可明显区分来源于肿瘤的肾组织和健康的组织(Guo,T.,Kouvonen,P.,etal.Nat.Medicine.2015,doi:10.1038/nm.3807.)。

然而，由于该方法在样本处理过程中由于难以去除，无法采用强的蛋白质提取试剂(如SDS等表面活性剂)，因此难以实现蛋白质组的深度覆盖分析。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种可用于蛋白质预处理的固相烷基化试剂。该试剂不仅可以实现蛋白质的高回收率捕获，而且还能实现与其它小分子的快速分离，降低蛋白质样品的复杂程度。为了实现该目的，本发明的技术方案是：

1)硅胶颗粒、无水甲苯、卤代硅烷化试剂混合后，搅拌回流6-24小时，制备修饰ATRP引发剂的硅胶颗粒；

它们用量为：硅胶颗粒1-100g、无水甲苯10-600mL、卤代硅烷化试剂0.1-12mL。卤代硅烷化试剂可为溴代硅烷化试剂和/或氯代硅烷化试剂；

2)通过原子自由转移聚合反应(ATRP)在载体表面上引入甲基丙烯酸缩水甘油酯的反应过程为：修饰ATRP引发剂的硅胶颗粒，甲醇、甲基丙烯酸缩水甘油酯、ATRP催化剂及配体试剂混合后，除气，回流反应2-24小时制得含环氧基团的硅胶颗粒(Si-GMA)；

它们用量为：修饰ATRP引发剂的硅胶0.5-10g、甲基丙烯酸缩水甘油酯1-25mL、甲醇10-300mL，ATRP催化剂5-100mg、配体试剂0.01-0.3mL。ATRP催化剂可为卤化亚铜(CuX)、卤化亚铁(FeX₂)或卤化亚钌(RuX₂)中的一种或二种以上；配体试剂可为2,2’联二吡啶(bpy)、N,N,N’,N”,N”’-五甲基二亚乙基三胺、2-吡啶甲醛缩正丙胺或六甲基三乙基三胺中的一种或二种以上。

3)然后通过共价键合方式依次修饰上树枝状亲水性化合物聚乙烯亚胺

(PEI)和碘乙酸-N-琥珀酰胺酯的反应过程为：

含环氧基团的硅胶颗粒(Si-GMA)表面引入亲水活性反应基团，具体步骤如下：

A.将Si-GMA分散于磷酸缓冲溶液中,加入PEI，搅拌反应4-12小时；

其中采用PEI的终浓度范围为1-100mg/mL；Si-GMA于磷酸缓冲溶液中的量为：Si-GMA 0.5-10g于磷酸缓冲溶液1-100mL中；