[发明专利]生化原料药杂蛋白的鉴别方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种杂质检测方法，尤其涉及一种生化原料药杂蛋白的鉴别方法。

背景技术

生化原料药，如：胰岛素、鱼精蛋白和尿激酶等，是从生物体分离，纯化所得，用于预防、治疗和诊断疾病的生化基本物质，以及用化学合成或基因重组等现代生物技术制得的这类物质。其主要类别有：氨基酸、肽、蛋白质、酶及辅酶、多糖、脂质、核酸及其衍生物。

生化原料药的杂质鉴别是一个难题，因此该类药品在药品注册申报或GMP认证时，一般不要求提供杂质谱文件资料。在药典中，生化药通常采用纯度的方式来表征。其原因在于：该类原料药可能包含的杂质往往与主药本身的结构与特性无关，而与起始物质的物种和特定纯化工艺有关。对于蛋白类生化原料药来说，其潜在杂蛋白可能包括起始物质所属物种的所有组成蛋白质。由于杂蛋白量少、面广且结构复杂，化学药品常用的杂质鉴别方法不能解决生化原料药杂质鉴别的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生化原料药杂蛋白的鉴别方法，以实现生化原料药中所含杂蛋白的鉴别。

本发明提供的一种生化原料药杂蛋白的鉴别方法，先用蛋白质组学的鉴别方法识别出样品中可能存在的杂蛋白，再用免疫试剂针对一种或多种可能存在的杂蛋白进行特异性检测。在必要的情况下，还可以测定杂蛋白的生物活性。

本发明中，蛋白质组学鉴别方法是先用蛋白水解酶(如：但不仅限于胰蛋白酶和V8蛋白酶)酶解初始样品或经过电泳分离(如：但不仅限于SDS-PAGE电泳和双向电泳)的样品，再经过液质联用仪器(如：LC/MS和LC/MS/MS等)获得酶解样品中所有肽段的分子量、电荷特征的生物信息学参数，最后用生物信息学软件(如：但不仅限于Bioworks软件)计算并联网搜库得到样品中可能存在的杂蛋白信息。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明提供的蛋白质组学鉴别方法，可以通过一次试验定性样品中几乎所有可能存在的蛋白质的信息，适用于生化原料药中可能存在的杂蛋白的广谱筛查；而免疫鉴别则可以对广谱筛查结果进行逐一的特异性检测，其结果具有确定性的特点。

因此，本发明通过蛋白质组鉴别方法和免疫鉴别方法结合使用，可以解决生化原料药中杂蛋白多样性和与主药无关性的问题，从而达到建立该类原料药杂蛋白谱的目的，并最终为提高生化原料药的质量安全性提供科学证据。

具体实施方式

以下详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自于国药集团化学试剂公司。

实施例1

尿促性素是一种从绝经妇女尿液中提取的促性腺激素制品，包含FSH、LH两种主药蛋白。但该品种主药成分含量很低，包含含量很高的杂质，主要是杂蛋白。

通过运用蛋白质组学方法(LC/MS/MS)对尿促性素肽图进行鉴别，结果表明该制品可能包含32种多肽/蛋白质，组成如下：

表1

由表1可见，尿促性素制品中，除主药FSH、LH的3种成分之外，可能还存在29种人体多肽/蛋白。除主药成分另行鉴别和定量检测外，我们检索到APOD有商品化的ELISA诊断试剂，此外还可获得乌司他丁的免疫血清。其它大部分可能存在的多肽/蛋白尚没有商品化的免疫试剂。

使用APOD-ELISA诊断试剂检测尿促性素制品，检测结果表明制品中APOD不存在。

使用乌司他丁免疫血清通过免疫双扩散方法检测尿促性素制品，检测结果表明制品中含有乌司他丁成分。

采用《中国药典》2010年版二部的方法，检测尿促性素制品中乌司他丁效价，结果表明制品中含有600IU/mg的乌司他丁成分。经过换算，尿促性素制品中，乌司他丁成分约含24％。

由此，我们可以确定尿促性素制品肯定含有乌司他丁杂质，无APOD杂质。

实施例2

尿促卵泡素是以尿促性素为起始物质的促性腺激素制品，主药成分是FSH，纯度达98％。

通过运用蛋白质组学方法(LC/MS/MS)鉴别尿促卵泡素，结果表明该制品可能包含23种多肽/蛋白质，组成如下：

表2