[发明专利]一种用于检测K-ras基因突变的引物、探针及检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及K-Ras基因突变的一种检测办法、引物探针及检测方法，属于分子生物学领域。

背景技术：

K-Ras基因是Ras家族的一员，该家族还包括H-Ras和N-Ras基因，被认为是一种癌症基因。K-Ras基因是表皮生长因子受体(EGFR)信号传导通路下游基因，可将细胞生长和分化信号由激活受体传导于蛋白激酶，作用之一是维持细胞内环境稳定，与细胞增殖、凋亡有关。K-Ras基因突变和过表达在肿瘤启动过程中具有重要的作用。研究表明K-Ras基因突变能够激活其下游的Raf/MEK/ERK和Ras/PI3K/Akt通路，从而导致正常细胞转变为肿瘤细胞，其突变与包括胰腺癌、肺癌等多种人类恶性肿瘤有关。

我国大肠癌发病率已占到常见肿瘤的第四位，且发病率已达5％，高于2％的国际水平；每年新发病例约40万，其中30～40岁的中年人居多。近年来，靶向药物为大肠癌治疗提供了新治疗方法，部分药物已经通过FDA审核作为转移性结直肠癌治疗药物，如抗VEGFR的单克隆抗体帕尼单抗(Panitumumab)及西妥昔单抗(Cetuximab)。但是，仅部分患者能从靶向治疗中获益，因此明确疗效预测因素非常重要。根据结直肠癌患者中K-Ras基因是野生型还是突变型，将传统意义上的一种疾病分成两种独立的疾病进行治疗。结直肠癌患者中K-Ras基因为突变型约占40％，野生型约占60％，目前临床治疗中抗EGFR靶向药物对野生型大肠癌患者疗效显著，而对突变型无效，如不加区分采用同一种药物治疗将会增加不良反应风险和治疗费用。因此，对K-Ras突变类型检测，可实现肿瘤病人的个体化治疗，从而达到良好的预后，延长患者生存期。

K-Ras基因最常见的激活方式是点突变，其中90％发生在第一外显子第12、13位密码子上，其中70％发生于第12位密码子，且多为GGT突变为GTT，30％发生于第13位密码子；极少有文献报道第19、61、63位密码子发生突变。第12位密码子常用的检测方法主要有DNA测序。

目前常用检测K-Ras突变基因的方法为核苷酸序列测定法、基因芯片技术、及实时荧光定量PCR法。其中核苷酸序列测定法可靠直观，并可检测出多位点变异，但耗时、灵敏度低，尤其在混合模板时，最低检出极限在10％以上；基因芯片技术具有大通量、快速、灵敏、平行检测基因优势，已在生物学的各个领域中广泛应用，但由于目前技术还不够成熟，所以有一定的假阳性和假阴性率，实验数据不容易解释，不可检测出新位点变异；PCR-RFLP法能有效鉴别不同基因型，简便、快速，无需特殊仪器，适合于一般实验室应用及大规模临床检验检测，但灵敏度不够，且该法操作中需开盖用PCR产物进行酶切，增加了产物污染的风险造成污染；实时荧光定量PCR法实现了PCR从定性到定量的飞跃，以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为分子生物学研究中重要工具，基本解决了过去实验过程因污染出现的假阳性，成为临床诊断中首选的核酸诊断技术。

目前，突变扩增阻滞系统(amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)已成为国际上肿瘤个体化分子检测最重要、最先进的技术之一，其在临床应用中的优势已被业内专家广泛认可。ARMS技术利用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大，并利用探针对扩增产物进行检测，在实时荧光定量PCR平台上实现对样品DNA中稀有突变的检测，以达到对基因突变检测的高特异性和高灵敏度。ARMS方法检测灵敏度明显高于直接测序法等其他方法，可检测出样品中含量低至0.1-1.0％的突变基因；在设计上可以最大限度地缩短目标产物的长度，可以解决石蜡包埋组织标本提取的DNA大部分片段化而无法得到准确检测结果的难点；结合实时PCR平台实现扩增时闭管操作，操作简单，无需产物的后处理，能最大程度地避免扩增产物污染。用于检测EGFR、KRAS、BRAF等基因突变具有简单、方便、快速、灵敏的优点，仅需90分钟即可得到准确结果，故易于在临床开展。

本发明通过ARMS-PCR方法检测分子靶向抗肿瘤药疗效相关的肿瘤相关基因K-ras12密码子的6种突变情况：反应管A检测密码子12GGT>GAT、12GGT>AGT置换突变、12GGT>GTT置换突变；反应管B检测密码子12GGT>TGT置换突变、12GGT>CGT置换突变、12GGT>GCT置换突变，以此来预测爱必妥等分子靶向药物治疗效果。

发明内容：

本发明目的是提供一种用于ARMS-PCR法检测K-ras密码子12突变情况的引物、探针。