[发明专利]一种聚乙二醇修饰蛋白的纯化工艺

说明书

技术领域

本发明涉及一种聚乙二醇修饰物的纯化新工艺，尤其涉及一种聚乙二醇随机修饰蛋白的纯化新工艺。

背景技术

蛋白质或多肽的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修饰即PEG化(pegylation)，是将活化的PEG通过化学方法以共价键偶联到蛋白质或多肽分子上。自1977年Davis首次采用PEG修饰牛血清白蛋白以来，PEG修饰技术迅速发展，并广泛应用于多种蛋白质和多肽的化学修饰，PEG修饰技术也从理论走向实际的药物应用。PEG修饰能赋予蛋白质和多肽类多种优良性能，具体表现为循环半衰期延长、免疫原性降低或消失、毒副作用减少以及物理、化学和生物稳定性增强等，在很大程度上扩宽了蛋白质和多肽的应用范围。其机理可能为：蛋白质PEG修饰后，相对分子质量(M r)增大，当修饰后的蛋白质的M r达到或超出肾小球滤过阈值时，蛋白质随血液循环进入肾脏后就可以逃避肾小球的滤过作用；由于PEG的屏蔽效应，使得修饰后的蛋白质或多肽不易受到各种蛋白酶的攻击，降解速率明显降低，稳定性提高，因而可以在血液循环中停留更长的时间；PEG在溶液中呈无规则卷曲，作为一种屏障，能掩盖蛋白质表面的抗原决定簇，使得蛋白质不能与各种细胞表面受体结合，不被机体的免疫系统识别，避免了相应抗体的产生，降低了蛋白质的免疫原性；PEG与蛋白质偶联后能将其优良的理化性质赋予蛋白质，如能改善蛋白质的生物分布和溶解性能。因此，蛋白质和多肽药物的PEG化成为领域研究的热点。

目前，已有多种PEG修饰的蛋白质和多肽用于生物医药领域，通过FDA批准进入市场，如PEG修饰的腺苷脱氨酶(PEG-ADA)、天冬酰胺酶(PEG-L-asparaginase)、干扰素α-2b(peginterferon alfa-2b)、干扰素α-2a(peginterferon alfa-2a)、重组人粒细胞集落刺激因子(pegfilgrastim)等。

在20种构成蛋白质的常见氨基酸中，只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行化学修饰。常用的反应氨基酸包括赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸，N-端氨基和C-端羧基。这些氨基酸残基上的反应性基团多呈亲核性，其亲核活性通常按下列顺序依次递减：巯基>氨基>羧基(羧酸盐)>羟基。根据化学修饰剂与蛋白质之间反应性质的不同，修饰反应主要分为酰化反应、烷基化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应等类型，对蛋白质进行氨基、巯基和羧基等侧链基团进行化学修饰。巯基通 常存在于蛋白质的二硫键和活性位点上，而羧基如果不与蛋白质上的氨基发生分子间或分子内中和反应，也很难活化。因此，蛋白质或多肽分子最容易与修饰剂发生作用的位点是分子表面赖氨酸残基上的氨基。

通常，在蛋白质中，氨基含量较高并且通常暴露于溶剂中，可以通过选择不同的修饰剂进行修饰。聚乙二醇修饰中，蛋白质可修饰氨基包含赖氨酸的ε氨基，N末端的α氨基，组氨酸的咪唑基，其中多数蛋白质赖氨酸含量大约是10％左右。并且在降低蛋白药物的免疫原性方面，由于随机修饰能够很好的把蛋白表面的抗原表位进行包裹，具有较好的效果，因此，针对氨基修饰的聚乙二醇修饰剂的研究较早也较为成熟。目前已上市的PEG修饰药物中，绝大部分产品也是随机修饰蛋白表面赖氨酸残基上的氨基的。而这其中，以聚乙二醇－羧酸的活化酯使用最为广泛。这类修饰剂通过和蛋白氨基酸侧链的氨基形成酰胺化和物而偶联到蛋白分子表面。这类修饰剂在和蛋白的反应过程中，由于本身水解会生成大量的酯类化合物。

蛋白PEG修饰产物的纯化和分析均较为困难。首先，蛋白经PEG分子修饰后，许多理化性质发生了改变，如等电点、分子质量、溶解度、沉降系数等；其次，由于PEG分子在水溶液中具有伸展的构象，其流体动力学体积远远大于同样分子质量的球状蛋白质，这使得球状蛋白质与PEG的分离非常困难，因此纯化得率较低；第三，由于PEG分子的不均一性，被用来修饰蛋白质的PEG分子，往往存在一定的分子质量分布，如美国Union Carbide公司提供的mPEG5000的相对分子质量为5000±250，因此，即使包含相同PEG个数的同一种蛋白分子，其相对分子质量也不完全相同。此外，蛋白质表面可修饰的氨基酸位点较多时，PEG分子可以结合在多个不同的氨基酸残基上，从而使PEG修饰蛋白的空间结构进一步复杂化。因此，即使是相同修饰度的蛋白分子之间，也会因修饰位点的不同而呈现多态性(Polydispersity)，这种多态性给修饰蛋白的分析和纯化带来了较大困难，这是目前该类产品开发的核心与难点所在。