[发明专利]一种抗菌肽菌丝霉素成膜剂及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种抗菌肽菌丝霉素成膜剂的制备方法，其特征在于，包括步骤：

A、抗菌肽菌丝霉素的表达载体的构建

将菌丝霉素基因序列插入毕赤酵母表达载体，得到重组质粒；

对重组质粒进行限制性酶切后电转到毕赤酵母中，然后在毕赤酵母中用培养基进行培养后，筛选出阳性转化子；

将上述阳性转化子进行摇床培养，然后将摇床培养后的部分菌液进行诱导培养，培养后再离心，收集上清液，得到菌丝霉素发酵液；

B、抗菌肽菌丝霉素成膜剂的制备

取1~3mL菌丝霉素发酵液，加入PVA充分搅拌、溶胀，加热溶解和过筛网，然后将得到的滤液于常温下静置；

在静置后的滤液中加入Tween-80和甘油，充分搅拌后，待常温，加入氮酮，搅拌均匀，最后加入用无水乙醇浸润的CMC-Na，充分搅拌直至完全溶解，得到抗菌肽菌丝霉素成膜剂；其中，PVA:Tween-80:甘油:CMC-Na按体积比为3~6:1.4~1.6:5~8:1.9~2.1。

2.根据权利要求1所述的抗菌肽菌丝霉素成膜剂的制备方法，其特征在于，所述步骤A具体包括：

A1、根据菌丝霉素的蛋白编码序列，设计毕赤酵母偏好性密码子，合成菌丝霉素基因序列，然后将菌丝霉素基因序列克隆到pUC57中，用XhoI、AvrII双酶切后，将菌丝霉素基因序列插入毕赤酵母表达载体，得到重组质粒；

A2、对重组质粒进行限制性酶切后电转到毕赤酵母中，然后用含500~1000μg/mL博莱霉素的YPD培养基于25~30℃下培养2~3d后，筛选出阳性转化子；

A3、将上述阳性转化子接种于含3mLBMGY培养基的离心试管中，25~30℃下220r/min摇床培养20~25h；然后将摇床培养后的部分菌液转移至BMMY诱导培养基中，25~30℃下220r/min进行诱导培养，每24h补加体积浓度比为1%的无水甲醇，再每24h于12000r/min离心5~10min，收集上清液，得到菌丝霉素发酵液。

3.根据权利要求1所述的抗菌肽菌丝霉素成膜剂的制备方法，其特征在于，所述步骤B中，所述PVA:Tween-80:甘油:CMC-Na按体积比为5:1.5:7:2.1。

4.根据权利要求1所述的抗菌肽菌丝霉素成膜剂的制备方法，其特征在于，所述步骤B中，所述筛网的目数为35~45目。

5.根据权利要求1所述的抗菌肽菌丝霉素成膜剂的制备方法，其特征在于，所述步骤B后还包括步骤：对抗菌肽菌丝霉素成膜剂的粘附力进行测试，粘附力测试步骤为：分别将9组抗菌肽菌丝霉素成膜剂均匀涂布在3×4cm²兔的腹部成膜，然后将靠近兔腹内侧一端膜折叠0.5cm，用夹子夹一塑料袋并用橡胶管向塑料袋中匀速滴水，直至膜破裂为止，记录重量，所得重量为抗菌肽菌丝霉素成膜剂的粘附力。

6.根据权利要求1所述的抗菌肽菌丝霉素成膜剂的制备方法，其特征在于，所述步骤B后还包括步骤：对抗菌肽菌丝霉素成膜剂的透气性进行测试，透气性测试步骤为：将抗菌肽菌丝霉素成膜剂均匀涂布于6×6cm²兔腹部成膜，然后选取厚度0.1~0.2μm的膜进行测试；将6g无水CaCl₂放入透气装置中，用所成的膜将瓶口密封置于37℃的恒温箱内，称量并记录1次/h；以质量变化与时间的关系作图，求出图中直线的斜率S，并根据下述公式求出薄膜的透气量Q；

其中，Q=（S/A）?（g/h?m²），式中：S为直线的斜率；A为膜的测试面积。

7.根据权利要求1所述的抗菌肽菌丝霉素成膜剂的制备方法，其特征在于，所述步骤B后还包括步骤：对抗菌肽菌丝霉素成膜剂的释药进行测试，释药测试步骤为：用生理盐水填充兔皮下内环境，将兔皮固定于单室透皮扩散池上，并控制单室透皮扩散池处于37℃水浴锅中，将2mL抗菌肽菌丝霉素成膜剂均匀涂在兔皮3×4cm²表面上，每隔1/2h从取药口吸取5mL液体，再用5mL生理盐水补充；将吸出的液体注入石英比色皿中，在波长λ=595nm处测定吸光度OD值，由线性方程计算出抗菌肽菌丝霉素成膜剂的释药浓度。