[发明专利]一种抗菌肽菌丝霉素成膜剂及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种抗菌肽菌丝霉素成膜剂及其制备方法与应用。

背景技术

奶牛乳房炎（BovineMastitis）是危害奶牛养殖业三大疾病之一，主要引起奶牛产奶量下降、乳品质降低以及生产性能下降。据报道国外奶牛乳房炎的发病率在20%~60%，而国内的发病率高达30%~70%，其中在临床型乳房炎平均发病率为21%~23%，隐形乳房炎奶牛发病率则高达50%~70%。每年由乳房炎造成损失很大如美国高达20亿美元，英国达2.67亿英镑，日本达5亿美元，德国达10亿欧元等。而我国每年因乳房炎造成的损失大约每头牛1200～3600元。由此可见，奶牛乳房炎给畜牧业带来了巨大的经济损失，严重威胁着人们的食品安全，制约着奶牛业的健康可持续发展。

奶牛乳房炎主要致病菌为金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌，其发病率很高。目前治疗奶牛乳房炎已从最初采用抗生素治疗，转变为中药疗法，但是中药治疗奶牛乳房炎用量大、疗效慢，已不是最理想治疗方法。因此，寻找一种高效、安全的新药代替目前普遍使用的抗生素和中药是目前防治奶牛乳腺炎的重要手段，也是畜牧业研究与生产的热点问题。

抗菌肽（antibacterialpeptides）又称抗微生物肽（antimicrobialpeptides，AMPs），是多种生物产生具有天然免疫反应的生物活性分子，通过入侵??病原微生物发挥细胞宿主防御作用。抗菌肽具有广谱抗菌活性、低毒和低耐药性、无残留和无污染，同时作为高等生物免疫调节剂被认为是一种未来具有前途和潜在的抗生素替代候选药物，属于环保型抗生素。除抗微生物活性功能外，抗菌肽还作为药物传递载体、抗肿瘤剂、促有丝分裂剂、避孕剂和信号转导分子以及饲料添加剂。因此，抗菌肽具有广泛的应用前景，但是由于它自身的特点，在与其他辅料混合、造粒过程中容易受多种微量元素、酸碱、外源蛋白酶的影响极大，同时造粒过程瞬时高温也会影响其生物活性；另外，抗菌肽易溶于水，大大降低其预防和治疗活性。

为了很好的提高抗菌肽的稳定性，同时利用现有的多肽制备技术将其制成肠溶包衣制剂、胶囊、微丸、微乳、脂质体、微粒、纳米粒等剂型，但是微乳、复乳制剂在包封率与稳定性方面较差，无法满足抗菌肽的包封需求，而脂质体由于用药量大、包封率低、稳定性差等缺点，不能满足抗菌肽制剂的制备要求。而肠溶包衣制剂、微粒、微囊和纳米粒又存在制备工艺复杂，成本较高，难以实现大规模化生产，同样不适合抗菌肽制剂的制备。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗菌肽菌丝霉素成膜剂及其制备方法与应用，旨在解决现有抗菌肽制剂制备方法包封率低、稳定性差及成本高的问题。

本发明的技术方案如下：

一种抗菌肽菌丝霉素成膜剂的制备方法，其中，包括步骤：

A、抗菌肽菌丝霉素的表达载体的构建

将菌丝霉素基因序列插入毕赤酵母表达载体，得到重组质粒；

对重组质粒进行限制性酶切后电转到毕赤酵母中，然后在毕赤酵母中用培养基进行培养后，筛选出阳性转化子；

将上述阳性转化子进行摇床培养，然后将摇床培养后的部分菌液进行诱导培养，培养后再离心，收集上清液，得到菌丝霉素发酵液；

B、抗菌肽菌丝霉素成膜剂的制备

取1~3mL菌丝霉素发酵液，加入PVA充分搅拌、溶胀，加热溶解和过筛网，然后将得到的滤液于常温下静置；

在静置后的滤液中加入Tween-80和甘油，充分搅拌后，待常温，加入氮酮，搅拌均匀，最后加入用无水乙醇浸润的CMC-Na，充分搅拌直至完全溶解，得到抗菌肽菌丝霉素成膜剂；其中，PVA:Tween-80:甘油:CMC-Na按体积比为3~6:1.4~1.6:5~8:1.9~2.1。

所述的抗菌肽菌丝霉素成膜剂的制备方法，其中，所述步骤A具体包括：

A1、根据菌丝霉素的蛋白编码序列，设计毕赤酵母偏好性密码子，合成菌丝霉素基因序列，然后将菌丝霉素基因序列克隆到pUC57中，用XhoI、AvrII双酶切后，将菌丝霉素基因序列插入毕赤酵母表达载体，得到重组质粒；

A2、对重组质粒进行限制性酶切后电转到毕赤酵母中，然后用含500~1000μg/mL博莱霉素的YPD培养基于25~30℃下培养2~3d后，筛选出阳性转化子；