[发明专利]一种结缕草的高效农杆菌转基因方法

权利要求书

1.一种结缕草的高效农杆菌转基因方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

1）从结缕草成熟种子中剥离出胚，将胚置于愈伤诱导培养基中培养至少3天；

2）对含有外源质粒的农杆菌进行活化，利用液体愈伤继代培养基对农杆菌进行悬浮，得到农杆菌悬浮液

3）将步骤1）培养所得植物组织置于步骤2）所准备的农杆菌悬浮液中，真空干燥器处理30分钟后，缓慢振荡培养1小时；

4）取出植物组织，置于含有乙酰丁香酮的固体愈伤继代培养基中避光共培养至少3天；所述乙酰丁香酮的浓度为20mgL^-1。

2.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，所述步骤1）的培养时间为7天。

3.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，所述步骤4）中，共培养时间为9天。

4.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，步骤2）中农杆菌的活化方法为：于200rpm、28℃下，对含有外源质粒的农杆菌进行培养，培养基含有5gL^-1酵母提取物、10gL^-1细菌蛋白胨、5gL^-1氯化钠、50mgL^-1卡拉霉素，pH为7.0，培养至OD₆₀₀=0.3-0.6。

5.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，利用MT4-S液体培养基对农杆菌进行悬浮时，调节悬浮液的OD₆₀₀=0.5。

6.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，所述外源质粒为含有植物抗性选择基因hpt基因和β-葡萄糖苷酸酶基因gus报告基因的pMDC99IG质粒。

7.根据权利要求6所述的转基因方法，其特征在于，所述含有植物抗性选择基因hpt基因和β-葡萄糖苷酸酶基因gus报告基因的pMDC99IG质粒是通过冻融法转入农杆菌中的。

8.根据权利要求1、4、5、7中任一项所述的转基因方法，其特征在于，所述农杆菌菌株为EHA105。

9.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，所述愈伤诱导培养基包含MS基础培养基中的成分和其它成分，所述其它成分包括：30gL^-1蔗糖、4mgL^-1维生素B1、100mgL^-1α-酮戊二酸、5mgL^-12,4-二氯苯氧乙酸、0.2mgL-¹6-苄氨基腺嘌呤，所述愈伤诱导培养基的pH值为5.8，用2gL^-1植物凝胶固化；所述液体愈伤继代培养基包含MS基础培养基中的成分和其它成分，所述其它成分包括：30gL^-1蔗糖、4mgL^-1维生素B1、100mgL^-1α-酮戊二酸、2mgL^-12,4-二氯苯氧乙酸、0.2mgL-¹6-苄氨基腺嘌呤，所述液体愈伤继代培养基的pH值为5.8；所述固体愈伤继代培养基的pH值为5.8，用2gL^-1植物凝胶固化。

10.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤1）前对结缕草成熟种子进行预处理，所述预处理步骤包括：

A）将种子在水中浸泡2天；

B)置于含1%活性氯的次氯酸钠溶液中搅拌灭菌2小时，然后用无菌水反复清洗。