[发明专利]一种甘蓝叶片小RNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物小RNA的提取方法，具体涉及一种甘蓝叶片小RNA的提取方法，属于小RNA提取技术领域。

背景技术

小RNA（smallRNA）是一类长20-30个核苷酸的非编码RNA分子，它一般通过与mRNA结合，在转录后水平上调控靶基因的表达，进而参与调控植物的生长发育。小RNA普遍存在于动植物中，数量较多，按照其生物合成特点，植物小RNA可以分为两类：微小RNA（microRNA，miRNA）和小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）两大类型。

miRNA是第一类被发现并具有重要功能的小RNA，其长度为20-23核苷酸。miRNA在不同物种中广泛分布，其数量因物种不同而存在差异。植物miRNAs经转录、DCL酶剪切后，形成miR/miR*双链复合体，随后miR*链降解，另一条成熟miRNA与AGO蛋白结合，构成RNA诱导的沉默复合体（RISC），这个复合体能与编码蛋白的靶基因mRNA结合，并在适当的位置对mRNA进行剪切或抑制翻译，从而对靶基因的表达进行调控。相关研究表明，miRNA在植物的生长、发育及胁迫响应中发挥重要的调控作用，因而越来越受到研究者的关注。

而高质量的小RNA是开展miRNA相关研究的重要前提。虽然提取小RNA的方法已有研究报道，例如Trizol、LiCl沉淀等，但是这些方法一般所需步骤繁琐，导致部分小RNA丢失，而且小RNA会伴有蛋白、糖类等污染。近年来，随着高通量测序技术的发展与应用，植物miRNA研究发展迅速，目前已经在拟南芥、水稻、杨树等模式植物上开展，而其他世界性植物（如甘蓝）miRNA研究才刚刚起步。

结球甘蓝（Brassicaoleraceavar.capitataL.）简称甘蓝，属十字花科芸薹属甘蓝种。甘蓝是一种重要的世界性蔬菜，在60°N以南，60°S以北的广大区域均有分布。在我国，甘蓝被广泛栽培种植，是蔬菜周年供应中的一种重要叶菜类蔬菜。甘蓝营养丰富，经常食用能提高人体免疫力、延缓衰老，此外还具有一定的抗癌功效，深受消费者喜爱。因此，甘蓝是备受研究者关注的蔬菜作物之一。关于甘蓝的研究报道较多，但内容多偏向于栽培技术、植物生理等方面，虽然分子生物学方面的研究工作已开展，但多集中在基因克隆、功能验证方面，miRNA研究才刚刚起步，因而开展甘蓝miRNA研究具有较大的研究空间，且具有重要研究意义。而获得高质量的小RNA是开展甘蓝miRNA相关研究的重要前提。目前小RNA提取方法常伴有蛋白、糖类等物质污染，小RNA浓度低等问题。

发明内容

解决的技术问题：针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种甘蓝叶片小RNA的提取方法，在浸提之前增加了样品裂解步骤，以保证样品裂解充分，克服现有小RNA提取方法常伴有蛋白、糖类等物质污染，小RNA浓度低等问题。

技术方案：本发明提供的一种甘蓝叶片小RNA的提取方法，其包括如下步骤：

步骤一、采集甘蓝叶片（甘蓝幼叶或者甘蓝老叶），立即于液氮中速冻，之后放于-80℃冰箱待用；

步骤二、取步骤一处理过的甘蓝叶片，置于液氮预冷的研钵中研磨成粉末，并向粉末中加入CTAB裂解液于离心管，混匀，室温放置3~5min，之后于离心机上12000rpm，4℃，离心5~10min；所述CTAB裂解液与甘蓝叶片的质量比为5:1；

步骤三、取步骤二离心所得液体的上清液，转移至新的离心管中，并向其中加入小RNA提取液（RNAisoforSmallRNA），混匀，室温放置3~5min，之后于离心机上12000rpm，4℃，离心5~10min；所述小RNA提取液与步骤二所述CTAB裂解液的质量比为1:1；

步骤四、取步骤三离心所得液体的上清液，转移至新的离心管中，并向其中加入上清液体积1/5的氯仿和异戊醇混合液，混匀，室温放置3~5min，之后于离心机上12000rpm，4℃，离心15~20min；

步骤五、取步骤四离心所得液体的上清液放于新的离心管中，并加入与上清液等体积的异丙醇，混匀，放于-20℃冰箱中静置1~2h，之后于离心机上12000rpm，4℃，离心10~15min；

步骤六、弃步骤五离心所得上清液，留沉淀，并用800~1500μL75%乙醇溶液清洗沉淀；室温晾干，再用30~50μL的RNasefreeddH₂O溶解沉淀，即得到甘蓝叶片小RNA。