[发明专利]5′RACERNA接头序列及用于扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA5′末端的试剂盒

权利要求书

1.含有5′RACE高效RNA接头序列的用于扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA 5′末端的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括5′RACE的高效RNA接头序列以及用于巢式PCR的5′RACE外侧引物和5′RACE内侧引物；

其中，所述RNA接头序列为：5'-GCGUGACCACUAGUCACGUCUGAGUUCGUCGCCAUUCCACAAA-3'；

所述5′RACE外侧引物和5′RACE内侧引物的序列如下：

5′RACE外侧引物：5'-ACTAGTCACGTCTGAGTTCG-3'

5′RACE内侧引物：5'-CGCGGATCCACGTCTGAGTTCGTCGCCATTCCAC-3'。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括T4RNA连接酶、RNA连接酶缓冲液、RNase抑制剂、反转录酶M-MLV、M-MLV缓冲液、dNTPs、Random 9mers、RNase Free dH₂O、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的至少一种。

3.利用5′RACE扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA 5′末端序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)根据目的基因已知的cDNA序列设计用于巢式PCR的上游外侧特异性引物GSP1和上游内侧特异性引物GSP2；

2)用T4RNA连接酶将5′RACE接头连接到miRNA剪切后的靶mRNA上；

3)以步骤2)的靶mRNA为模板，Random 9mers为反转录引物，用反转录酶M-MLV进行反转录合成cDNA；

4)以步骤3)的cDNA为模板，进行巢式PCR反应，用上游外侧特异性引物GSP1和5′RACE外侧引物进行第一轮PCR反应，再用上游内侧特异性引物GSP2和5′RACE内侧引物进行第二轮PCR反应；

5)分析PCR产物；

其中，步骤2)中所述5′RACE接头的序列如下：5'-GCGUGACCACUAGUCACGUCUGAGUUCGUCGCCAUUCCACAAA-3'；

步骤4)中所述5′RACE外侧引物和5′RACE内侧引物的序列分别如下：

5′RACE外侧引物：5'-ACTAGTCACGTCTGAGTTCG-3'

5′RACE内侧引物：5'-CGCGGATCCACGTCTGAGTTCGTCGCCATTCCAC-3'。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)中引物设计原则如下：

①引物长度为20-28nt；

②引物中GC含量为45％-55％，GC、AT分布均匀，避免局部富含GC或AT；

③引物不形成二级结构，与5′RACE外侧引物和5′RACE内侧引物不形成复杂结构；

④引物3′端的3-4个碱基不与配对引物形成互补序列。