[发明专利]5′RACERNA接头序列及用于扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA5′末端的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种用于5′RACE的高效RNA接头序列及用于扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA 5′末端的试剂盒，所述RNA接头序列可以扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA 5′末端序列，从而进行miRNA的靶基因验证。

背景技术

cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3’末端的有效方法，是根据基因已知的部分序列扩增未知片段的最佳方法。RACE技术概括地说就是通过逆转录和PCR的有机结合，扩增基因未知片段的技术。利用基因编码区3’端的已知序列，获得5’端未知序列的技术称为5’-RACE，是目前扩增5’端未知基因完整编码序列的最常用技术。

5’-RACE基本原理：首先获得包含目的基因mRNA的RNA样品，并利用基因特异的引物进行逆转录，获得目的基因相应的cDNA；在cDNA的3’末端(对应mRNA序列5’末端)加上特定的序列，通常将这段添加在cDNA上的特定序列称为接头(adaptor)，同时合成与adaptor序列相匹配的引物，称为锚定引物；然后利用基因已知序列设计基因特异性引物，与锚定引物配对进行PCR扩增，得到未知部分的片段；再将扩增得到的片段测序，即可获得目的基因未知部分的序列。

目前按接头序列的添加方法可分为3大类：末端转移酶法(terminaldeoxynucleotidyl transferase method，TdT方法)、接头连接法(adaptor ligation)和寡核苷酸帽法(oligo capping method)。

寡核苷酸帽法又称RLM-RACE。真核生物mRNA具有一个3’尾巴和一个5’帽子结构，该技术正是利用5’端的帽子特性对全长分子进行富集和扩增，可以更精确的定位转录起始位点。目前基于该方法的试剂盒有TaKaRa、Clontech和Ambion等厂家都有生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种更高灵敏度、更高特异性的扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA的5′末端的5′RACE RNA接头序列。

本发明的另一目的是提供含有上述5′RACE RNA接头序列的用于扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA 5′末端的试剂盒。

为了实现本发明目的，本发明提供的用于5′RACE的高效RNA接头序列，所述RNA接头序列为：5'-GCGUGACCACUAGUCACGUCUGAGUUCGUCGCCAUUCCACAAA-3'(Seq ID No.1)。

本发明还提供含有上述接头序列的用于扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA 5′末端的试剂盒。

前述的试剂盒还包括用于巢式PCR的5′RACE外侧引物和5′RACE内侧引物，引物序列如下：

5′RACE外侧引物：5'-ACTAGTCACGTCTGAGTTCG-3'(Seq ID No.2)

5′RACE内侧引物：5'-CGCGGATCCACGTCTGAGTTCGTCGCCATTCCAC-3'(Seq ID No.3)

前述的试剂盒还包括T4RNA连接酶、RNA连接酶缓冲液、RNase抑制剂、反转录酶M-MLV、M-MLV缓冲液、dNTPs、Random 9mers、RNase Free dH₂O、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液等中的至少一种。

本发明还提供利用5′RACE扩增miRNA剪切后的靶基因cDNA 5′末端序列的方法，包括以下步骤：

1)根据目的基因已知的cDNA序列设计用于巢式PCR的上游外侧特异性引物GSP1和上游内侧特异性引物GSP2；

2)用T4RNA连接酶将5′RACE接头连接到miRNA剪切后的靶mRNA上；

3)以步骤4)的靶mRNA为模板，Random 9mers为反转录引物，用反转录酶M-MLV进行反转录合成cDNA；

4)以步骤5)的cDNA为模板，进行巢式PCR反应，用上游外侧特异性引物GSP1和5′RACE外侧引物进行第一轮PCR反应，再用上游内侧特异性引物GSP2和5′RACE内侧引物进行第二轮PCR反应；

5)分析PCR产物。