[发明专利]一种养分高效利用转基因玉米材料快速鉴定的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因植物材料快速鉴定的方法，具体涉及一种养分高效利用转基因玉米材料快速鉴定的方法。

背景技术

随着植物细胞生物学和分子生物学的发展，利用生物基因工程技术将能够提高玉米氮、磷肥利用效率的基因导入玉米，改良玉米自身性状已成为可能。当前，转基因玉米已经在全世界范围内广泛种植，全球种植的转基因作物面积和比例连年增加，同时随着转基因技术的快速发展，国外转基因作物大量进入我国。因此，转基因植物的检测技术成为转基因产品安全性评价的重要技术平台，如何快速有效地鉴定转基因植物、种子等，在转基因植物研制开发或对转基因产品进行筛选或安全性评价时，对于科研单位、商检、海关和农业执法部门等具有重要的实用价值。

目前，转基因植物的检测技术主要有除草剂鉴定、试纸条鉴定以及PCR鉴定技术。其中，在植物转基因研究过程中，通常采用选择性标记基因提高转化筛选效率，而草铵膦乙酰转移酶基因(phosphinothricinacetyltransferasegene，bar)是玉米转基因研究中常用的筛选标记基因，草铵膦可以强烈抑制植株内的谷氨酰胺合成酶的活性，导致细胞内氨的迅速积累，随叶绿体结构解体，最后整个植株中毒死亡。因此，利用筛选标记基因的农艺性状，建立快速有效的非生物鉴定方法非常必要。待玉米生长至5～6叶期时喷洒草铵膦，8～10d之后，野生型玉米叶片逐渐变黄枯萎，有明显中毒症状，当草铵膦浓度大于2000mg/L时，野生型植株叶片褐化直至全部死亡，而含有Bar基因的玉米叶片没有黄化症状，生长正常，表现出对草铵膦的良好抗性，使用该浓度的草铵膦溶液喷洒玉米叶片，即可准确、有效地鉴定转基因与非转基因玉米植株。因此，该方法可用于鉴定含抗除草剂标记基因Bar基因的养分高效利用转基因玉米植株。然而喷洒草铵膦除草剂，筛选养分高效利用的转基因玉米材料的缺点主要是假阳性高、反应速度慢等；若草铵膦没有完全喷洒玉米植株，玉米植株会在受伤后继续恢复生长，造成假阳性；同时，喷洒除草剂后通常要一周左右才能看到植株反应效果，鉴选时间较长不利于及时获知结果。

在试纸条鉴定中，草铵膦乙酰转移酶基因(phosphinothricinacetyltransferasegene，bar)为抗除草剂基因，编码蛋白一膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)。该基因广泛应用于基因工程育种中的抗除草剂基因，也是遗传转化中的标记基因。养分高效利用转基因玉米使用Bar基因作为标记基因，它使玉米抵抗以L-phosphiothricin(PPT)为活性成分的草铵膦除草剂，通过Bar试纸条分子检测法能够快速鉴定转基因材料中的Bar蛋白，检测时取Bar试纸条将标有箭头和“max”端置于玉米叶片研磨上清液中1～2cm左右，一般等待3～5min，试纸条上端出现质控线，最长反应时间为20min，表示混合液中含有来自于样品的蛋白，试验结果有效。如果样品含有Bar蛋白，则在质控线下方出现测试线；若不出现测试线，则表示样品中不含有Bar蛋白，该鉴定方法为快速有效的筛选大量转基因材料节约大量时间。然而Bar试纸条检测结果呈阳性，也还只是处于“海选”阶段，需要进一步将初步筛选出的阳性材料进行PCR定性筛选检测，才能最终确定是否真正含有转基因物质；同时Bar试纸条检测成本较贵，约为25元/样品。

在转基因玉米研究和培育时，阳性植株的筛选、插入序列分析、安全检测一般都离不开分子检测，最常用的分子检测手段是PCR(聚合酶链反应)检测。PCR检测的基础是提取满足检测需要的基因组DNA，然后以提取的待检测转基因玉米材料基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增后通过电泳系统分辨目的基因条带，有目的片段出现的样品即为转基因阳性植株，反之为阴性非转基因植株。然而PCR定性筛选检测，检测费用为每次1000元左右；在研究或者筛选群体较大(如转基因植株的大批量筛选、遗传规律分析等)时，提取基因组DNA就会成为一项繁重的工作，并成为检测和筛选速度的一个重要制约因素。因此，PCR鉴定成本较高、方法步骤繁琐，做大量鉴定，运用时有一定的局限性。

综上，现有养分高效利用转基因植物鉴定方法鉴定手段单一，要么是苗期喷施除草剂筛选鉴定，要么是简单的进行Bar试纸条检测，要么是全材料提取基因组DNA进行PCR验证，方法上太过局限和不灵活。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种具有简便、快速、准确、灵敏度和特异性高、经济实用、适合于全生育期检测等特点的养分高效利用转基因玉米材料快速鉴定的方法。