[发明专利]一种高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂，其特征在于：所述的高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂为将鸡白细胞介素12的构建到真核表达载体pCAGGS中，获得重组鸡白细胞介素12的真核表达载体pCAGGS-IL12。

2.根据权利要求1所述的高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂，其特征在于：所述的重组鸡白细胞介素12通过下述的四对引物扩增的获得：

IL12亚单位P40的扩增引物对：

IL12-p40-F1：SEQIDNO：1；

IL12-p40-R1：SEQIDNO：2；

IL12亚单位P35的扩增引物对：

IL12-p35-F1：SEQIDNO：3；

IL12-p35-R1：SEQIDNO：4；

IL12亚单位P40的拼接引物对：

IL12-p40-F2：SEQIDNO：5；

IL12-p40-R2：SEQIDNO：6；

IL12亚单位P35的拼接引物对：

IL-12-p35-F2：SEQIDNO：7；

IL-12-p35-R2：SEQIDNO：8。

3.权利要求1或2所述的高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂的制备方法，其特征在于：上述的高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂的制备方法为：采用(G4S)3疏水的柔性氨基酸接头连接的方案获取rIL-12的P40、P35融合基因，融合基因插入真核表达质粒pCAGGS，构建pCAGGS-IL12。

4.根据权利要求3所述的高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂的制备方法，其特征在于：所述的采用(G4S)3疏水的柔性氨基酸接头连接的方案获取rIL-12的P40、P35融合基因的制备方法，包括以下步骤：

(1)首先单独设计引物分别扩增IL12亚单位P40和P35，获得IL12亚单位P40和P35基因片段，其中IL12亚单位P40的扩增引物对序列如下：

IL12-p40-F1：SEQIDNO：1；

IL12-p40-R1：SEQIDNO：2；

IL12亚单位P35的扩增引物对序列如下：

IL12-p35-F1：SEQIDNO：3；

IL12-p35-R1：SEQIDNO：4；

(2)以步骤(1)扩增获得IL12亚单位P40和P35基因片段为模板，用含酶切位点和互补的linker(G4S)3的连接引物去扩增，获得IL12亚单位P40和P35基因的拼接片段，上游目的基因P40去掉终止密码子TTA，下游目的基因P35去掉起始密码子ATG，所述的连接引物如下：

其中，IL12亚单位P40的拼接引物对序列如下：

IL12-p40-F2：SEQIDNO：5；

IL12-p40-R2：SEQIDNO：6；

IL12亚单位P35的拼接引物对序列如下：

IL-12-p35-F2：SEQIDNO：7；

IL-12-p35-R2：SEQIDNO：8；

(3)再次分别以步骤(2)胶回收获得的拼接片段产物按照总量1:1的比例，加入Taq酶和dNTPs，PCRbuffer，进行第一轮PCR反应，循环数为8～12；第一轮PCR反应后取出2μL反应混合物作为模板，以IL12-p40-F2和IL-12-p35-R2为模版，进行第二轮PCR，循环数28～35；产物回收，送测序鉴定正确后获得采用(G4S)3疏水的柔性氨基酸接头连接的方案获取rIL-12的P40、P35融合基因。

5.权利要求1或2所述的高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂的应用，其特征在于：将重组鸡白细胞介素12真核表达载体与新城疫DNA疫苗共同通过电穿孔的方法免疫动物，重组鸡白细胞介素12真核表达载体发挥分子佐剂的作用。