[发明专利]一种高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于疫苗技术领域，特别涉及一种高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂及其制备方法和应用。

背景技术

新城疫是由新城疫病毒引起的禽类的急性、高度接触性传染病，免疫预防新城疫一直应用灭活疫苗或者弱毒苗，但是灭活疫苗免疫保护期短，而弱毒苗免疫保护效果好，但存在潜在毒力返强及与野毒基因重组的危险，因此，对DNA疫苗的研究越来越多。F基因是NDV的主要毒力因子与保护性抗原，但是，根据文章表明，单独的F基因构建的DNA疫苗通过普通的肌肉注射，是达不到理想保护效率，因此，对分子佐剂和免疫途径则需要进行进一步的探索。IL-12是一种由的异源二聚体蛋白组成的细胞因子，编码IL-12两个亚基(p35、p40)的基因位于不同的染色体上，二者分别合成后再通过亚基间二硫键结合成具有生物学活性的二聚体分子(p70)。单独的亚基不具有生物学作用，IL-12能够促进T淋巴细胞、NK细胞的分化与增殖，调控细胞免疫，提高NK/LAK细胞的杀伤功能和特异性CTL细胞的应答能力，诱导γ干扰素的产生；因此，选择IL12作为佐剂能够增强核酸疫苗的免疫效果。此外，电穿孔是功能强大的将核酸、蛋白及其它分子导入多种细胞的高效技术。通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的外源分子。与普通的肌肉注射相比，电穿孔能有效的减免DNA疫苗在进入细胞过程中的损失，提高了疫苗的表达效率，有效地减少了剂量，提高免疫效果。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂。所述的分子佐剂为重组鸡白细胞介素12(rhIL-12)真核表达载体，所述的rIL-12真核表达载体(pCAGGS-IL12)与DNA疫苗共同通过电穿孔的方法免疫动物，发挥分子佐剂的作用。rIL-12佐剂能够克服新城疫DNA疫苗研究中保护率较低的困难，提供一种有效的DNA疫苗佐剂及一种高效率的免疫途径。

本发明的另一目的在于提供上述分子佐剂的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述分子佐剂的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂，为重组鸡白细胞介素12(rhIL-12)的真核表达载体pCAGGS-IL12。

所述的重组鸡白细胞介素12通过下述的四对引物扩增的获得：

IL12亚单位P40的扩增引物对：

IL12-p40-F1：ATGTCTCAGCTGCTCTTTGCCCTAC；

IL12-p40-R1：TTATCTACAGAGCTTGGACCACTC；

IL12亚单位P35的扩增引物对：

IL12-p35-F1：ATGGCTGAGCAGGGCATAGGCATC；

IL12-p35-R1：TTAGATCTCAGCAGTCAGGGCAC；

IL12亚单位P40的拼接引物对：

IL12-p40-F2：CGGAATTCGCCACCATGTCTCAGCTGCTCTTTGCCCTAC；

IL12-p40-R2：TCCGCTACCGCCTCCACCAGAGCCTCCTCCACCTCTACAGAGCTTGGACCACTC；

IL12亚单位P35的拼接引物对：

IL-12-p35-F:GGTGGAGGCGGTAGCGGAGGCGGAGGGTCGGCTGAGCAGGGCATAGGC；

IL-12-p35-R2：CCCTCGAGTTAGATCTCAGCAGTCAGGGCAC。

上述的高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂的制备方法为：

采用(G4S)3疏水的柔性氨基酸接头连接的方案获取rIL-12的P40、P35融合基因，融合基因插入真核表达质粒pCAGGS，构建pCAGGS-IL12。上述载体的构建方法不仅可保证P40、P35两亚基以1∶1比率表达，而且柔性氨基酸接头可使两个亚基充分延展、正确折叠，从而获得最大的生物学活性。

上述的采用(G4S)3疏水的柔性氨基酸接头连接的方案获取rIL-12的P40、P35融合基因的制备方法，包括以下步骤：

(1)首先单独设计引物分别扩增IL12亚单位P40和P35，获得IL12亚单位P40和P35基因片段，其中IL12亚单位P40的扩增引物对序列如下：

IL12-p40-F1：ATGTCTCAGCTGCTCTTTGCCCTAC；