[发明专利]黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及药物化学及生物医药技术领域，具体涉及一种黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取方法，以及该大豆素单体化合物在制备抗肝癌药物和抗肺癌药物中的应用。

背景技术

黄绿蜜环菌(Armillarialuteo-rivens)，又名黄蘑菇、金蘑菇、黄环菌，隶属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、蜜环菌属。黄绿蜜环菌子实体中等大，菌盖扁半球形至平展，直径5-12cm，菌盖边缘内卷，表皮开裂形成近环状排列的纤毛状后磷片。菌褶近似菌盖色，稍密，弯生，不等长。菌柄柱形，茎部膨大，长2-10cm，直径2-2.5cm，白色或或带黄色，内实。菌环中位，单层，菌环以上为白色，菌环以下为黄色鳞片。在显微镜下观察，担孢子椭圆形，无色至微黄色，淀粉质，担孢子棒状，无色，具4个孢子，菌丝具明显锁状联合。菌丝分布在土壤5-10cm。该菌夏秋季生于针叶林地或草地上，尤其喜生于高山草地上，菌丝可与主要植被为嵩草和高山杂类草等形成菌根。在牧草生长季节，由黄绿蜜环菌菌丝顶端生长，在草地上形成或大或小的圆圈、半圆或条带状的蘑菇圈。圈的宽度大约为50cm，圈的直径大约6cm左右(周连玉.黄绿蜜环菌的研究概述.安徽农学通报[J].2010,16(3):52-54)。

国内对黄绿蜜环菌营养成分进行了初步分析，富含氨基酸、蛋白质、多糖多肽等营养和药用成分，具有较高的保健和药用价值。但目前的蜜环菌制剂主要以初提混合物为原料，如郭顺星等在“蜜环菌的化学成分及应用研究”(微生物学通报[J].1996,23(4):239-240)中提出：蜜环菌糖浆以蜜环菌培养液(菌丝连同发酵液)为主要原料，煮沸浓缩制成，主治眩晕头痛，神经衰弱，失眠，美尼尔综合症；蜜环菌浸膏以菌丝体为原料，煮沸、过滤，残渣醇析，醇析物与滤液合并浓缩制成，用于治疗血管性头痛、神经衰弱、冠心病、脑动脉血管硬化等病；蜜环菌片以菌丝体烤干后磨成细粉压片而成，对高胆固醇血症、高甘油三酯血症、降低血压有一定效果。由于蜜环菌制剂成分一般为混合物，缺乏必要的药效物质基础和药效研究，所以其缺乏合理的质量控制标准，难以确保临床用药的有效性、安全性、可持续性。可见，对黄绿蜜环菌的化学成分进行进一步提取和研究非常有必要。

袁兴利等在“蜜环菌的化学成分研究”(中国中药杂志[J].2013,38(16):2671-2674)提出以蜜环菌发酵培养物(包含菌丝体和发酵液)为原料进行有效成分提取：采用95％乙醇浸提后，用闪式提取器提取，合并提取液并浓缩；经两次硅胶柱色谱和一次Sephadex LH-20色谱柱，并使用不同的洗脱剂进行分离纯化后，得到大豆素(化学名5,7-二羟基-3-(4-羟苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮、4',5,7-三羟基异黄酮)单体化合物。但是使用该方法步骤繁琐，成本高，得到的大豆素含量极少，得率比较低，3.5kg干燥的蜜环菌发酵培养物只得到10mg大豆素，这大大限制了大豆素的进一步研究和应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取方法，该方法采用二维高效液相色谱进行分离纯化，得到具有生物活性的大豆素单体化合物，分离方法稳定，重复性高，制备量大，操作简单省时，成本低，大豆素提取率高。

本发明所采用的技术方案为：

一种黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取方法，该方法包括以下步骤：

(1)以黄绿蜜环菌子实体为原料，经干燥并磨成粉末状后，用乙酸乙酯以液固比(5-10)mL︰1g进行浸泡24-48h，然后过滤取上清，得到乙酸乙酯提取液，并浓缩至膏状；

(2)使用乙醇体积分数为10-35％的正己烷-乙醇二元混合溶剂溶解步骤(1)得到的膏状乙酸乙酯提取物，得到100-150mg/mL的上样溶液；

(3)对上样溶液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为50-150mL/针，流动相流速为550-600mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210-260nm；采用的洗脱方式为B相浓度由0％至75％(即按体积百分比B相75％、A相25％混合而成的液体，下同理)进行梯度洗脱45-75min，根据紫外吸收光谱收集23-26分钟洗脱液作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分；

(4)用乙醇体积分数为2-15％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为50-100mg/mL；