[发明专利]RNA5mC重亚硫酸盐测序的文库构建方法及其应用

权利要求书

1.提高重亚硫酸盐处理后的RNA样品的逆转录效率的方法，其特征在于：

利用ACT三碱基随机六聚引物对重亚硫酸盐处理后的RNA样品进行逆转录，合成cDNA。

2.根据权利要求1的方法，其中所述RNA是mRNA、tRNA、rRNA、总RNA或其它包含或可能包含5mC甲基化位点的RNA。

3.根据权利要求1的方法，其中RNA样品是非甲基化RNA标准品与分离纯化的待测RNA以1:100(重量比)的比例混合的混合物。

4.根据权利要求3的方法，其中所述非甲基化RNA标准品是小鼠DHFR基因的RNA序列。

5.根据权利要求1的方法，其中所述重亚硫酸盐处理基本上完全将RNA样品中的未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。

6.RNA 5mC重亚硫酸盐测序文库构建方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将RNA样品片段化；

(2)对片段化的RNA样品进行重亚硫酸盐处理；

(3)利用ACT三碱基随机六聚引物对重亚硫酸盐处理后的RNA样品进行逆转录，合成cDNA；

(4)用逆转录合成的cDNA构建测序文库。

7.根据权利要求6的测序文库构建方法，其中所述测序文库适合于在Illunima Hiseq测序平台上进行测序。

8.一种5mC甲基化RNA的测序方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将RNA样品片段化；

(2)对片段化的RNA样品进行重亚硫酸盐处理；

(3)利用ACT三碱基随机六聚引物对重亚硫酸盐处理后的RNA样品进行逆转录，合成cDNA；

(4)用逆转录获得的cDNA构建测序文库；

(5)进行高通量测序。

9.一种RNA 5mC甲基化检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将RNA样品片段化；

(2)对片段化的RNA样品进行重亚硫酸盐处理；

(3)利用ACT三碱基随机六聚引物对重亚硫酸盐处理后的RNA样品进行逆转录，合成cDNA；

(4)用逆转录合成的cDNA构建测序文库；

(5)进行高通量测序；

(6)对测序结果进行数据分析，获得RNA的5mC甲基化信息。

10.根据权利要求8的方法，其中所述高通量测序为在Illunima Hiseq 2000测序平台上进行测序。

11.根据权利要求9的方法，其中所述高通量测序为在Illunima Hiseq 2000测序平台上进行测序。

12.根据权利要求6-11任一项的方法，其中所述RNA是mRNA、tRNA、rRNA、总RNA或其它包含或可能包含5mC甲基化位点的RNA。

13.根据权利要求6-11任一项的方法，其中RNA样品是非甲基化RNA标准品与分离纯化的待测RNA以1:100(重量比)的比例混合的混合物。

14.根据权利要求13的方法，其中所述非甲基化RNA标准品是小鼠DHFR基因的RNA序列。

15.根据权利要求6-11任一项的方法，其中所述重亚硫酸盐处理基本上完全将RNA样品中的未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。

16.根据权利要求6、7、12-15任一项的测序文库构建方法构建的测序文库，

17.权利要求16的测序文库在RNA甲基化检测中的应用。

18.ACT三碱基的随机六聚引物在RNA 5mC甲基化检测中的应用，所述RNA 5mC甲基化检测包括将RNA样品片段化、重亚硫酸盐处理、逆转录合成cDNA、高通量测序和数据分析的步骤，其特征在于：在对重亚硫酸盐处理后的RNA进行逆转录时，使用ACT三碱基的随机六聚体作为引物。

19.根据权利要求18的应用，其中RNA样品是非甲基化RNA标准品与分离纯化的待测RNA以1:100(重量比)的比例混合的混合物。

20.根据权利要求19的应用，其中所述非甲基化RNA标准品是小鼠DHFR基因的RNA序列。