[发明专利]RNA5mC重亚硫酸盐测序的文库构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因组测序技术领域，具体的，涉及一种通过利用只含ACT三碱基的随机六聚引物对重亚硫酸盐处理的RNA片段进行逆转录后的文库构建方法及其在5mC高通量测序中的应用。

背景技术

RNA同时具有调控和信息分子的双重功能，在众多细胞机制中发挥着核心作用。RNA转录后的修饰为RNA功能的多样化奠定了化学基础。自然界中的RNA修饰广泛存在于A、U、C、G四类核苷酸上。截止目前，RNA修饰数据库RNAMDB共收录了109种RNA的修饰形式，其中甲基化修饰约占RNA修饰总量的80％，这类甲基化修饰主要发生在碱基基团的氮原子N上，以及嘌呤和嘧啶的C原子上，或2’-OH氧原子等特殊位置上。RNA核苷上的甲基化反应主要依赖于生物体内的甲基转移酶及甲基基团供体完成。6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)，是发生在碱基A第六位N原子上的甲基化修饰，作为真核生物中最常见的一种RNA转录后修饰，因其丰富的含量和高度的保守型，近年来得到了广泛的关注和研究。

除m6A外，5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)是另一种在RNA中广泛存在的甲基化修饰形式。虽然5mC修饰在DNA研究中已被广泛报道，而在RNA中的研究尚处于起步阶段。早在20世纪70年代5mC就已被发现存在于仓鼠细胞的mRNA中，其修饰位点的分布特征以及生物学功能等仍不清楚，直到近期对于RNA 5mC的基因组水平上的单位点检测及生物学功能 的研究才有了初步探索。

和m6A一样，RNA 5mC修饰也应该是动态可逆的，甲基转移酶以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，将甲基转移到胞嘧啶C形成5-甲基胞嘧啶(5mC)。RsmB是第一个被发现的RNA 5mC甲基转移酶，主要催化细菌rRNA上的甲基化形成。随后30多种RNA上的5mC甲基转移酶陆续被发现，这些甲基转移酶主要可分为NOP2/NOL1,YebU/Trm4,RsmB/Yn1022c和PH1991/NSUN四类，而且这些酶在真核生物中有很高的保守性，近年来NSUN蛋白家族被广泛深入研究。人的NSUN蛋白家族共有9个蛋白，该家族的多个成员都具有潜在的5mC甲基转移酶功能结构域，其中NSUN2的催化活性已被证实。除NSUN2外，DNMT2也被认为可能是哺乳动物的RNA5mC甲基转移酶，它和NSUN2的催化位点有一定的交集。其它的酶如NSUN1和NSUN3-7被预测可以催化一些保守的甲基化位点的甲基化过程。NSUN1、NSUN2、NSUN5已被证实能结合RNA，但这些酶的特异性结合底物并不是很清楚。

利用5mC抗体免疫沉淀结合亚硫酸氢盐处理测序的结果发现了古生菌mRNA中的多个5mC修饰，其保守序列为AU(m5C)GANGU，和古生菌的rRNA上的保守序列一致，说明mRNA和rRNA上的5mC修饰可能通过同一种甲基转移酶催化形成。

DNA中5mC的去甲基化反应由TET家族蛋白催化介导，而近期一项研究表明TET蛋白也能介导RNA 5mC去甲基化形成5hmC，而且相较于TET1对DNA的高度活性，TET3对RNA的选择性似乎更强。针对RNA 5mC去甲基化酶的研究还有待更深入的探索。

相比m6A，5mC在mRNA中的功能研究还并不深入。基于现有研究推测，5mC的修饰可能会调控mRNA的选择性剪接，5mC修饰水平可能会影响外显子的保留水平以及转录本的组装形式。除此之外，5mC还可能与蛋白质翻译以及mRNA的稳定性有较为密切的关系。总之，5mC修饰在RNA中广泛存在而且其功能可能涉及到包括细胞内信号转导，组织发育分化和癌症 等许多方面，而对mRNA中5mC位点的检测和分布规律的探索，5mC修饰酶及结合蛋白的发现将有助于阐述5mC修饰对mRNA加工代谢的调控机制。