[发明专利]诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱的建立方法

权利要求书

1.一种诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）大蒜蒜酶灭活提取物待测溶液的制备：称取诱导愈伤组织培养大蒜鳞茎20g，加25-30ml蒸馏水，90℃灭酶1h，破碎研磨，加甲醇定容至50ml，5000×g离心15min，取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤；

（2）大蒜蒜酶灭活提取物供试品溶液的制备：C18固相萃取小柱经5ml甲醇、10ml超纯水活化，平衡15min；待测溶液以4ml/min速度过柱，再用5ml超纯水淋洗，低真空抽干；再由5ml甲醇洗脱后，室温下低流速氮气浓缩至0.5-0.8ml，再以甲醇定容至1ml，经0.45μm微孔滤膜过滤待测；

（3）高效液相色谱分析：色谱柱为：EclipsePlusC18，5μm，4.6x250mm；保护柱为：EclipsePlusC18Grd，5μm，4.6x12.5mm；柱温35℃；流动相为甲醇和0.2%甲酸水溶液；采用梯度淋洗方式0→2min→10min→20min，甲醇：60%→60%→80%→80%；二极管阵列检测器检测波长240nm；进样量50μL；在上述条件下分析供试品溶液，得到诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱；

（4）重复上述（1）至（3），对10批次诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物建立HPLC指纹图谱，通过比较分析确定了14个共有特征峰，其保留时间分别为：2.178min、2.756min、2.946min、3.382min、3.823min、4.712min、6.511min、7.088min、8.021min、9.143min、10.639min、13.107min、14.973min、18.391min，相对标准偏差（RSD）<1%，这些共有特征峰构成了诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC标准指纹图谱。

2.一种诱导愈伤组织培养大蒜品种鉴别和生产质量控制方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）大蒜蒜酶灭活提取物待测溶液的制备：称取诱导愈伤组织培养大蒜鳞茎20g，加25-30ml蒸馏水，90℃灭酶1h，破碎研磨，加甲醇定容至50ml，5000×g离心15min，取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤；

（2）大蒜蒜酶灭活提取物供试品溶液的制备：C18固相萃取小柱经5ml甲醇、10ml超纯水活化；待测溶液以4ml/min速度过柱，再用5ml超纯水淋洗，低真空抽干；5ml甲醇洗脱后室温下低流速氮气浓缩至0.5-0.8ml，再以甲醇定容至1ml，经0.45μm微孔滤膜过滤待测；

（3）高效液相色谱分析：色谱柱为：EclipsePlusC18，5μm，4.6x250mm；保护柱为：EclipsePlusC18Grd，5μm，4.6x12.5mm；柱温35℃；流动相为甲醇和0.2%甲酸水溶液；采用梯度淋洗方式0→2min→10min→20min，甲醇：60%→60%→80%→80%；二极管阵列检测器检测波长240nm；进样量50μL；在上述条件下分析供试品溶液，得到大蒜蒜酶灭活提取物HPLC色谱图；

（4）将步骤（3），得到的大蒜HPLC色谱图与诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC标准指纹图谱进行对比，通过对其所含化学成分差异的分析鉴别大蒜品种或品质质量。