[发明专利]诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱的建立方法

说明书

本发明得到“天津市农委重点项目（201302030）和天津师范大学应用开发研究基金”资助。

技术领域

本发明属于涉及诱导愈伤组织培养植物指纹图谱的构建方法，尤其是诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物高效液相色谱(HPLC)指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱。

背景技术

大蒜(AlliumsativumL.)百合科葱属，二年生草本植物，食药兼用，在世界范围内被广泛种植。目前，我国是最大的大蒜生产国，国内种植大蒜69.2万公顷，占世界种植面积的1/2左右，我国大蒜的总产量占世界总产量3/4以上，产量1208.8万吨。大蒜作为人们生活中必不可少的蔬菜和调味品，营养丰富，含有多种对人体有益的化学成分，包括其中含硫挥发物43种，硫化亚磺酸（如大蒜素）酯类13种、氨基酸9种、肽类8种、糖苷类12种、酶类11种等。大蒜鳞茎、幼苗及花茎均可食用。大蒜还具有较强的药用价值，具有杀菌、消炎、抗病毒、抗癌、降血脂等功效。但目前在农业生产上，由于大蒜常年进行无性繁殖，致使大蒜花叶病毒、洋葱黄矮病毒、韭葱黄条纹病毒、青葱潜隐病毒、大蒜普通潜隐病毒、洋葱螨传潜隐病毒、马铃薯Y病毒和烟草花叶病毒等病原体在大蒜母体内传播，逐代积累，导致大蒜优良种性不断退化，严重影响大蒜产量。

植物组织培养脱毒快繁技术能有效地降低大蒜体内的病毒，使大蒜保持优良种性，提高农业生产上的繁殖系数。植物组织培养是指在无菌环境条件下，人工控制温度、光照、湿度、营养、激素等条件，利用培养基提供养分，对离体的植物器官、组织、细胞或者原生质体进行培养，使其再生细胞或形成完整植株的生物技术。本发明涉及的材料取自农艺性状优良的宝坻特有大蒜品种“六瓣红”，经过愈伤组织培养所培育的大蒜。

宝坻特有品种“六瓣红”大蒜，蒜头致密紧实，一般每头6瓣左右，单柱型围座，无加楔，无重瓣，蒜瓣洁白脆嫩，辛辣汁多味浓，易贮藏，耐运输，抗病性较强，辣味柔和适口，生、熟食用俱佳。“六瓣红”大蒜以其优良的农艺性状、丰富的营养成分以及良好的口感，一直保持着名优特产的地位，深受国内外消费者喜爱，目前已远销日本、韩国及东南亚等多个国家和地区。

如何评价诱导愈伤组织培养植物是否完全继承亲本植物所具有的优良农艺性状，既全面评估和控制愈伤组织培养植物的品质质量，是这一技术应用于农业生产方面亟待解决的问题。

指纹图谱技术已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的最有效手段之一。它可以较全面、准确、直观的反映多种成分在中药或其制剂中的分布，是一种综合的、宏观的和可量化的鉴别方法。运用指纹图谱技术，通过对指纹图谱中主要特征峰的识别或比例的测定，可以鉴别中药材和中成药的真伪，有效评价产品质量的均一性和稳定性

蒜氨酸酶是大蒜中的一类内源酶，存在于细胞液泡内，蒜氨酸则以稳定的形态存在于细胞质中。当大蒜鳞茎收到外力作用，细胞结构遭到破坏，蒜氨酸酶与蒜氨酸相接触，发生酶解反应，生成一系列蒜氨酸代谢产物如二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚等。由此可见，在提取过程中使蒜酶灭活，可充分反应大蒜中天然状态下的化合物成分。但是目前有关诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物的指纹图谱还未见报道。

鉴于以上不足，有必要发明一种建立诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物指纹图谱的新方法，使之能够简便、稳定、可重复、全面、精确的评价诱导愈伤组织培养大蒜的质量，从而既加强了对诱导愈伤组织培养大蒜真伪鉴别能力，又能提高了诱导愈伤组织培养大蒜质量的全面评估和控制，弥补了现有检测方法的不足，使之更加科学、完善。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有诱导愈伤组织培养大蒜品质管理检测方法的不足，而提供一种诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱的建立方法。该方法通过将诱导愈伤组织培养大蒜制备成蒜酶灭活提取物待测溶液，经固相萃取技术分离浓缩，再经由高效液相色谱仪分析检测，获得指纹图谱，为其真伪鉴别以及品质控制提供可靠依据和技术方法。

本发明诱导愈伤组织培养大蒜蒜酶灭活提取物HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：该方法按如下的步骤进行：

（1）大蒜蒜酶灭活提取物待测溶液的制备：称取诱导愈伤组织培养大蒜鳞茎20g，加25-30ml蒸馏水，90℃灭酶1h，破碎研磨，加甲醇定容至50ml，5000×g离心15min，取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤；