[发明专利]一类两亲性吲哚方酸菁染料及其长效标记溶酶体的应用

说明书

技术领域

本发明属于化学合成及生物标记技术领域，特别涉及一类两亲性吲哚方酸菁染料的合成及其在特异性溶酶体标记方面的应用。

背景技术

随着人们对生命科学探索的不断深入，细胞甚至亚细胞层次上的生命活动更加引人关注。溶酶体是一种存在于真核生物细胞内的重要亚细胞器，是细胞的“消化器官”。溶酶体与生物体健康息息相关，人类的许多疾病如矽肺、肺结核等都与溶酶体有关。因此利用生物荧光成像技术，对细胞溶酶体进行观察与监测有着重要意义。

目前的能够实现溶酶体靶向物质主要分为抗体及荧光染料。其中，抗体的价格昂贵且在生物体内容易失活；荧光染料的染色稳定性差，仅可在较短时间内标记溶酶体，不能用于对溶酶体的长时间观察。

吲哚菁染料是生物荧光标记中一类重要的成像剂。与常用的罗丹明、荧光素等有机染料相比，吲哚菁的紫外吸收和荧光发射位于近红外区，这可以有效避免成像时生物体自身的背景干扰，从而提高检测的灵敏度。目前商业化的吲哚菁染料的应用范围仅限于静态的细胞膜标记且标记时间很短，并不能标记其他亚细胞器或用于长时间动态监测细胞。而且商业化染料多为油溶性，在生物体内易聚集而导致荧光猝灭。同时，对有机助溶剂的依赖也进一步增加了其生物毒性。因此为了更好的研究细胞的生命活动，开发一种能水溶、标记时间更长并且能够监测细胞动态的成像试剂具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一类两亲性吲哚方酸菁染料及其合成方法，该类染料可用于活细胞溶酶体标记，并能够实现对活细胞长时间动态监测。

本发明使用4号位由溴、氢或甲基取代的苯肼盐酸盐为原料，制备得到带有上述三种取代基且带有羧基功能化的吲哚方酸菁染料，然后通过羧基与伯胺的缩合反应进一步将氨基引入染料分子。由于方酸基团的引入，染料具有较好的光稳定性，染料结构包含疏水部分及带有伯胺的亲水部分，具有两亲性，无需有机助溶剂即可直接用于细胞标记，因此具有较低的细胞毒性。染料的疏水部分可通过疏水作用嵌插到溶酶体膜中；亲水端的氨基质子化后带正电荷，可与细胞膜表面的负电基团静电相吸。在活细胞中，由于溶酶体内为弱酸性，氨基在此会完全质子化，静电作用更加强烈，因此染料与溶酶体膜的结合力更强。

本发明所述的两亲性吲哚方酸菁染料结构式为：

其中，R为H，Br，或CH₃。

上述的两亲性吲哚方酸菁染料的合成方法为：

1).将10-20mmol4-R基苯肼盐酸盐及10-24mmol3-甲基-2-丁酮加入到5-20mL的冰醋酸中，回流反应8-20小时，悬蒸除去溶剂后，用二氯甲烷溶解，并用饱和NaHCO₃水溶液洗涤至水相无色、pH中性，取有机相旋蒸除去溶剂，得到5-R基-2，3，3-三甲-3H-基吲哚；

2).将3-10mmol的5-R基-2，3，3-三甲-3H-基吲哚与3-12mmol的对卞溴基苯甲酸加入10-20mL乙腈中，回流反应10-20小时，旋蒸除去溶剂后用乙醚沉淀并洗涤，干燥后得到中间产物吲哚啉衍生物；

3).将1-5mmol步骤2)合成的吲哚啉衍生物与0.5-2.5mmol的3,4-二羟基-3-环丁烯-1,2-二酮加入10-20mL甲苯和正丁醇的混合溶液中，甲苯和正丁醇的体积比为1:0.8-1.5，并加入5-10mL吡啶；在氮气保护下，缓慢升温至100-120℃，15-30小时后用乙醚沉淀得到中间产物吲哚方酸菁衍生物；

4).将0.5-1mmol步骤3)合成的吲哚方酸菁衍生物、2-4mmol的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和2-4mmol二异丙基乙胺加入5-10mmolN,N-二甲基甲酰胺中，室温下反应15-30分钟后加入N-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺4-5mmol，继续室温下反应2-8小时后用乙醚沉淀得到叔丁氧羰基保护的吲哚方酸菁衍生物；

5).将0.1-1mmol叔丁氧羰基保护的吲哚方酸菁衍生物与5-10mL三氟乙酸加入至5-10mL二氯甲烷中，室温下反应2-10小时后旋蒸除去溶剂并用乙醚沉淀，得到两亲性吲哚方酸菁染料；

步骤1)和2)中的R为H，Br，或CH₃。

上述的两亲性吲哚方酸菁染料在活细胞中标记溶酶体的应用。

本发明具有如下有益效果：

1.本发明设计合成的两亲性吲哚方酸菁染料紫外吸收和荧光发射均位于近红外区，在生物成像过程中可大大降低背景荧光的干扰；