[发明专利]一种定量检测miRNA的RT-PCR方法有效
申请号: | 201510558101.5 | 申请日: | 2015-09-02 |
公开(公告)号: | CN105177132B | 公开(公告)日: | 2018-12-28 |
发明(设计)人: | 苟德明;康康;张利敏;牛燕琴;王志伟;吴伊可;张小英 | 申请(专利权)人: | 苟德明;康康 |
主分类号: | C12Q1/686 | 分类号: | C12Q1/686 |
代理公司: | 北京市盈科律师事务所 11344 | 代理人: | 马丽丽;刘雪花 |
地址: | 518000 广东省深圳市南山区*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 定量 检测 mirna rt pcr 方法 | ||
1.一种定量检测miRNA的RT-PCR方法,其特征在于,miRNA加Poly(A)尾和逆转录在同一反应体系中进行,利用S-Poly(T)引物进行miRNA的逆转录;
包含以下步骤:
S1、加尾逆转录:miRNA加Poly(A)尾和逆转录在一个反应体系中完成,利用S-Poly(T)引物进行miRNA的逆转录;
S2、PCR:以步骤S1中逆转录获得的第一链cDNA为模板进行real-time PCR定量检测;
加尾逆转录的反应体系包含:3±1μL体液总RNA或100±20ng细胞总RNA,1±0.2μL的0.5 μM逆转录引物,1±0.2U的多聚腺苷酸聚合酶,100±20U的鼠白血病逆转录酶,2.5μL的4×反应缓冲液,无RNA酶水补足至10 μL;
所述4×反应缓冲液包含200±20mM Tris-HCl,600±50mM NaCl,40±10mM MgCl2,4±0.5mM ATP,2 ±0.5mM dNTP,pH 8.0;
加尾逆转录的反应条件为:37~42℃保温60 min,75℃保温5 min,迅速置于冰上,静置2min;
所述细胞或体液总RNA的提取方法如下:
1) 向含1 mL的RNAiso-Plus的离心管中加入100 μL体液样本或106个细胞,吹打混匀,室温静置5 min;加入200 μL氯仿,盖紧离心管盖,剧烈振荡20 s;室温静置5 min;
2)12,000 g,4℃离心15 min;吸取500 μL上清液转移至另一新的离心管中;向移除上清液的离心管中加入与移除上清液等体积的无RNA酶水,混匀,12,000 g,4℃离心15 min;吸取500 μL上清液到另一个新的离心管;
3)分别向上述2份上清液中加入糖原溶液,使糖原终浓度为1.875~120 μg/mL,再加入与等体积的异丙醇,上下颠倒充分混匀,-20℃或-80℃静置至少10 min;
4)13,500 g,4℃离心10 min;弃去上清液,向沉淀中加入1 mL的75%乙醇,轻轻颠倒清洗沉淀;13,500 g,4℃离心5 min,完全弃去上清;
5) 沉淀在室温下干燥2~3 min,加入20 μL无RNA酶水溶解。
2.根据权利要求1所述的定量检测miRNA的RT-PCR方法,其特征在于,加尾逆转录的反应体系包含:3μL体液总RNA或100ng细胞总RNA,1μL的0.5 μM 逆转录引物,1U的多聚腺苷酸聚合酶,100U的鼠白血病逆转录酶,2.5μL的4×反应缓冲液,无RNA酶水补足至10 μL。
3.根据权利要求1所述的定量检测miRNA的RT-PCR方法,其特征在于,所述4×反应缓冲液包含200 mM Tris-HCl,600 mM NaCl,40mM MgCl2,4 mM ATP,2 mM dNTP,pH 8.0。
4.根据权利要求1所述的定量检测miRNA的RT-PCR方法,其特征在于,加尾逆转录的反应条件为:37℃保温30 min,42℃保温30 min,75℃保温5 min,迅速置于冰上,静置2 min。
5.根据权利要求1所述的定量检测miRNA的RT-PCR方法,其特征在于,糖原浓度为15μg/mL。
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