[发明专利]一种定量检测miRNA的RT-PCR方法

说明书

本发明涉及一种定量检测miRNA的RT‑PCR方法，miRNA加Poly(A)尾和逆转录在同一反应体系中进行,利用S‑Poly(T)引物进行miRNA的逆转录。本发明S‑Poly(T)Plus法中，miRNA的Poly(A)加尾和逆转录将在一个反应体系中同步完成，操作简便，缩短时间，用于合成cDNA的时间至少减少0.5h，具有更高的逆转录效率。本发明结合S/P miRsol RNA法和S‑Poly(T)Plus法，建立了一种非常灵敏、高效、简便、快捷、廉价的从提取到检测的技术体系。该技术体系尤其适合于从miRNA丰度较低的生物体液样本中检测miRNA。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种定量检测miRNA的RT-PCR方法。

背景技术

microRNA(miRNA)是一类长约22个核苷酸非编码小RNA，广泛存在于动物、植物、线虫等真核生物中。miRNA的主要功能是通过与mRNA的3’端非翻译区(3’-UTR)结合来抑制基因的表达，降解靶mRNA或者阻止其翻译，从而在转录后水平上调控基因的表达。miRNA广泛参与细胞的分化、增殖、凋亡、个体生长发育以及器官形成。生物体内miRNA被精密调控，其表达具有严格的时空特异性。研究表明miRNA的表达与许多癌症或者其他疾病的发生密切相关，而且miRNA可以在血液中以非常稳定的形式存在。循环miRNA可用于癌症等重大疾病的早期诊断和基因药物的作用靶点，是有着巨大潜力的新型生物标记物。

长期以来，基于实时定量PCR(qRT-PCR)的检测技术一直以来都被认为是最灵敏的miRNA检测手段之一，比较常用的有Poly(A)加尾法(Shi R,Biotechnique.2005,39(4):519-525)和茎环引物(Stem loop)法(Chen C,Nucleic Acids Res.2005,33(20):1-9)。Poly(A)加尾法是利用Poly(A)聚合酶使miRNA的3’端带上一段Poly(A)尾巴，然后用含有Oligo(dT)序列引物进行逆转录。由于逆转录的引物的通用性，因此Poly(A)加尾法在降低检测成本的同时，也降低了检测的特异性和灵敏性。茎环引物法中逆转录引物5’端含有一个茎环结构，3’端通常具有6个与miRNA配对的碱基，可以增强miRNA和DNA异质双链的亲合力，并防止引物与pri-或pre-miRNA退火。但是由于茎环引物法使用的是序列特异性探针，在高通量的miRNA分析中成本相对昂贵。

随后，Kang K等发明了一种新型的检测miRNA的方法S-Poly(T)法，分别在其专利申请CN102154505A(在该专利中称为S-Oligo(dT)法，所用引物称为S-Oligo(dT)引物)和文章(Kang,K,PloS one.2012.7,e48536.)中进行了公开。在S-Poly(T)方法中，所用引物从5’端开始依次是14～20个碱基的PCR通用引物序列，14～20个碱基的通用探针序列，8～30个dT及与目的miRNA分子的3’端3～8个核苷酸互补配对的特异性序列。相比于Poly(A)加尾法和茎环引物法，S-Poly(T)方法的特异性和效率都大大提高。但是在S-Poly(T)方法中，miRNA的Poly(A)加尾和逆转录是两步独立的反应，因此在操作简便性和逆转录效率方面，S-Poly(T)技术还有待改进和提高。

发明内容

鉴于以上现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种更为简便、灵敏、高效、廉价的定量检测miRNA的RT-PCR方法。

为了实现上述发明目的，本发明包含以下技术方案：

一种定量检测miRNA的RT-PCR方法，miRNA加Poly(A)尾和逆转录在同一反应体系中进行，利用S-Poly(T)引物进行miRNA的逆转录。

优选地，所述定量检测miRNA的RT-PCR方法，包含以下步骤：

S1、加尾逆转录：miRNA加Poly(A)尾和逆转录在一个反应体系中进行，利用S-Poly(T)引物进行miRNA的逆转录；