[发明专利]一种假丝酵母生产(S)-甲基苯乙醇的方法

说明书

技术领域

本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到近平滑假丝酵母细胞生物催化制备手性医药中间体(S)-(3-甲基苯)乙醇的技术。

背景技术

手性(S)-(3-甲基苯)乙醇是合成手性药物、精细化学品、农药品和其他特殊材料的重要中间体。生物催化不对称反应具有环境友好、条件温和、选择性高等优点,作为绿色高效制备手性化合物的优先途径,被越来越多地应用于生产一些高附加值的手性化合物。生物催化制备手性(S)-(3-甲基苯)乙醇具有很好的应用前景。

生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点,是可持续发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中手性拆分和不对称合成是生物催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中,水解酶能够催化动力学拆分外消旋体得到手性产品,在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来,氧化还原酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前,采用水解酶动力学拆分法、生物还原法和生物氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为4:2:1。

生物还原法相对于动力学拆分法而言,最大的优势在于理论收率可达100%,原子经济性好。然而生物还原反应需要辅酶或辅因子的参与,一定程度上限制了其应用。由于辅酶依赖性的缘故,生物还原反应中多釆用整细胞作为催化剂,实现体内辅酶循环再生的同时免去了酶的分离纯化步骤。

(S)-(3-甲基苯)乙醇是合成手性药物、精细化学品、农药品的重要手性砌块，。现有的方法普遍存在转化率低、反应时间长、需要添加昂贵辅酶、成本高等严重缺陷，难于进行工业化生产。本发明将采用生物细胞催化制备(S)-(3-甲基苯)乙醇。

发明内容

本发明采用近平滑假丝酵母细胞催化制备(S)-(3-甲基苯)乙醇，反应式如下：

底物3-甲基苯乙酮（1）经近平滑假丝酵母催化反应，得到产物(S)-(3-甲基苯)乙醇（2）。有多种微生物可以催化此反应，经过大量实验筛选，最终确定采用近平滑假丝酵母作为催化剂，因为其催化反应的效果最好，反应收率、对映体过量率（ee%）均很高。

许多近平滑假丝酵母都可以进行生物催化此反应，然而，其效果不同，相差很大，经实验，本发明选用近平滑假丝酵母菌株为ATCC200954，其催化反应效果最佳。

由于绝大多数氧化还原酶是辅酶NAD(P)H依赖型,而细胞本身所含有的辅酶量可能较少,因此,进行氧化还原反应时,为促进辅酶再生，提高反应效率，在反应体系中还添加辅助底物构成转化体系。常用的辅助底物种类较多，不同细胞所需的辅助底物不同，效果差别很大，采用几种辅助底物组合，可以取得较好效果，需进行大量实验才能确定最佳的辅助底物。本发明经过大量实验确定的辅助底物为：葡萄糖20-23g/L、木糖10-14g/L、异丙醇8-10%V/V(体积浓度)。

由于底物溶解度较低，所以，加入表面活性剂以增加底物的溶解度。

培养介质：

1、　种子培养基成份为:酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，pH7.0;配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。

2、培养液成份：葡萄糖37-44g/L,木糖7-8g/L，玉米胚芽粉10-12g/L，酵母提取物4-5g/L,(NH₄)₂HPO₄12-15g/L,KH₂PO₄6.5-7.5g/L.MgSO₄.7H₂O　0.7-0.8g/L,NaCl　0.08-0.1g/L;pH7.0。

2、固体培养基成份：在液体培养基中加入2%的琼脂粉。

酵母细胞制备。近平滑假丝酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，121℃高压灭菌30分钟，冷却至29-31℃，将近平滑假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为6-6.5％，通气比为0.5-1V/（V分钟），29-31℃培养42-48小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。

生物催化转化