[发明专利]菜用大豆中平头炭疽菌的特异性PCR检测引物及其检测方法

说明书

本发明公开一对用于检测菜用大豆炭疽病菌的PCR引物及其检测方法，所述引物包括上游引物CTF1：5'‑CC CTGAAAAGGACGTCTCC‑3'和下游引物CTR1：5'‑GCTAGAGTCCCTCCGAA TCC‑3'，在所述引物基础上建立菜用大豆炭疽病菌PCR检测方法，可在菜用大豆炭疽病菌纯DNA和带菜用大豆炭疽病菌的发病豆荚组织中特异性地扩增出片段大小为426bp的扩增产物。本发明的检测引物和检测方法可用于田间菜用大豆炭疽病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，克服了传统检测、鉴定方法步骤繁琐、周期长等问题，本发明所提供的引物及方法对菜用大豆炭疽病菌进行检测具有准确性高、特异性强、灵敏度高、检测过程操作简便快速等优点。

技术领域

本发明涉及菜用大豆炭疽病菌特异性PCR检测引物及其检测方法，专用于菜用大豆炭疽病菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于田间菜用大豆炭疽病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。

背景技术

菜用大豆又称为毛豆，因味道鲜美、营养丰富而深受广大消费者的喜爱，正逐渐成为具有较高经济价值的蔬菜之一，给城郊农户带来较大的经济效益，也是我国南方部分省市春季主要栽培的出品创汇的农产品之一，产品大量用于保鲜和速冻加工。然而在菜用大豆种植过程中尤其在结荚至收获上市期间，由平头炭疽菌[Colletotrichum truncatum(Schwein.) Andrus & W.D.Moore] 侵染引起的炭疽病在豆荚上严重发生，感病品种一般田块株发病率为50%左右，豆荚发病率为30%左右，重病田块株发病率达90%以上，豆荚发病率达50%以上，极大地影响了豆荚的商品性及其经济价值，是菜用大豆生产上的一种重要病害，并且其发生危害有日益严重的趋势。菜用大豆炭疽病菌具有潜伏侵染的特性，在发病初期症状一般不明显，常给病害的正确诊断造成极大的困难，在生产中常因病害诊断不准确，未能达到实施“对症下药”的正确防治措施而致使病害造成惨重损失的现象时有发生。因此建立菜用大豆炭疽病菌快速检测体系，在发病早期对植株是否携带炭疽病菌进行快速准确的检测，这对于病害的准确预测预报、制定适时有效的防治措施、控制病害的传播和流行（蔓延）以及减少病害造成的经济损失都具有重要的理论和实际意义。

随着分子生物学技术的发展，应用聚合酶反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增技术对植物病原菌进行特异、灵敏的快速分子检测的成功例子已越来越多。国内外已有研究人员利用真菌核糖体转录间隔区ITS（internal transcribed spacer）基因为病原菌检测靶标，开发出了灰霉菌、疫霉菌、枯萎病菌、链格孢等不同病原真菌的特异性检测引物，并利用特异性引物进行PCR扩增，达到病原菌快速、准确的检测和鉴定。真菌核糖体转录间隔区ITS序列以中性的方式进化，速度与物种形成的进程相仿，ITS在种内相当保守，而在种间表现出一定的变异，是区分种或种下阶元的理想分子标记。炭疽病菌传统的分类鉴定和检测主要基于形态学特征及致病性测定和生理生化特征等，这种鉴定方法耗时较长、程序繁琐、灵敏度低，而且还要求鉴定者具有良好的经验和专业背景知识，难以满足病害防控中快速、灵敏、稳定的检测要求，很容易错过病害防治的最佳时期，而基于PCR方法的分子鉴定只要求工作者有简单的分子操作技能。目前，尚未见有关菜用大豆炭疽病菌（C.truncatum）分子检测鉴定方法。本发明通过对炭疽菌属（Colletotrichum）的ITS序列进行比对分析，设计出1对可用于特异性检测菜用大豆炭疽病菌的引物，为菜用大豆炭疽病菌的准确鉴定和快速检测提供技术和方法，有利于及早有效地采取防治措施。

发明内容