[发明专利]一种用于赭曲霉毒素A富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种用于赭曲霉毒素A富集净化的免疫磁珠的制备方法，其是以粒径2.8μm的羧基磁珠为载体，羧基磁珠末端具有反应活性的羧基基团，在经活化剂EDC-NHS组合处理后，活化磁珠与赭曲霉毒素A单克隆抗体进行偶联，制备成能够富集净化赭曲霉毒素A的免疫磁珠，其特征在于：所述赭曲霉毒素A单克隆抗体是用赭曲霉毒素A人工抗原免疫白鼠所得到的，所述赭曲霉毒素A人工抗原是赭曲霉毒素A半抗原与载体蛋白的偶联物，所述赭曲霉毒素A半抗原是按照如下方法制备得到的：

Ⅰ、将100mg赭曲霉毒素A溶于5mL丙酮中，再加入50μL 3-溴丙缩醛和40mg碳酸钾，回流反应5h，停止反应，加水-乙酸乙酯萃取，分去水相，加无水硫酸钠干燥蒸干，得到粗产物，加石油醚洗涤结晶，得到中间产物；

Ⅱ、将中间产物加乙醇溶解后，再加入2mL稀盐酸和5mL蒸馏水，60℃反应4h，停止反应，加氢氧化钠水溶液调节pH到6，加二氯甲烷萃取，蒸干，加乙醚重结晶，得到赭曲霉毒素A半抗原，其分子结构式为：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述赭曲霉毒素A人工抗原是按照如下方法制备得到的：18mg赭曲霉毒素A半抗原溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺中，50mg载体蛋白溶于3.75mL pH 9.6的0.1mol/L CB缓冲液中，将半抗原溶液加入到蛋白溶液中，4℃搅拌反应24h；再加入0.25mL pH7.0的1mol/L赖氨酸溶液，4℃反应2h，将得到的产物透析，得到所述赭曲霉毒素A人工抗原，其分子结构式为：

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：

(1)清洗：取100μL羧基磁珠于离心管中，用100μL含0.05％吐温-20的pH5.0、25mmol/L的MES溶液洗涤2次，磁分离后移除上清；

(2)活化：用4℃贮存的pH5.0、25mmol/L MES溶液分别配制50mmol/L的EDC、NHS溶液；分别加入50μL新配制的EDC和NHS溶液到装有磁珠的离心管中，涡旋混匀，室温活化30min，磁分离后移除上清，同(1)MES溶液洗涤2-3次；

(3)偶联：将赭曲霉毒素A单克隆抗体溶解到60μL pH5.0、25mmol/L MES溶液中，用所述MES溶液调节总体积至100μL，轻柔加入到已活化磁珠中，室温偶联30min或4℃偶联2h，期间使磁珠保持混匀状态；

(4)封闭：磁分离后移除上清，加入100μL pH7.4的TRIS溶液反应15min封闭磁珠；

(5)保存：磁分离后移除上清，用100μL含0.1％-0.3％牛血清白蛋白、0.1％吐温-20的TRIS溶液洗涤封闭好的磁珠3-5次，磁分离后移除上清，将磁珠复溶于含0.1％-0.5％牛血清白蛋白、0.01％-0.1％吐温-20、0.02％NaN₃的TRIS溶液中，2-8℃保存备用。