[发明专利]一种用于赭曲霉毒素A富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及赭曲霉毒素A样本的富集净化处理工艺，具体涉及一种用于赭曲霉毒素A富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用。

背景技术

赭曲霉毒素是赭曲霉及青霉菌中某些产毒菌株侵染粮食、食品、饲料及其他农副产品后所产生的有毒代谢产物。赭曲霉毒素A是赭曲霉毒素中毒性最强、产量最高的一种，对人和动物有强烈的毒害作用，可以导致动物的肾萎缩、胎儿畸形、流产、死亡，并且具有高度的致癌性。赭曲霉毒素A在大麦、小麦、燕麦、玉米等大多数谷物中存在。用受赭曲霉毒素A污染的谷物饲养的家禽也会受到污染，赭曲霉毒素A直接或间接危及人体健康。因此，赭曲霉毒素A是继黄曲霉毒素后又一个引起世界关注的毒素。1993年，国际癌症研究院(The International Agency for Researchon Cancer)将赭曲霉毒素A定为2B组致癌物质(可能是人类致癌物)。各国纷纷制定了谷物中赭曲霉毒素A的限量标准，第56次FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会会议对赭曲霉毒素A进行了危险性评价并制定了谷物食品中赭曲霉毒素A最大残留量标准为5μg/kg，我国和欧盟及其成员国也规定在谷物中最大残留量为5μg/kg。

目前食品中赭曲霉毒素A的主要提取方法包括有机溶剂萃取法、免疫亲和层析法等。有机溶剂萃取法是目前最普遍的提取方法，但有机溶剂的萃取存在过程复杂、毒性大、所需时间长等缺点，而且由于最终提取物中可能存在其他荧光物质、色素、结构类似物，从而对检测结果产生干扰；免疫亲和层析提高了试样的净化效果，同时可显著减少有毒有害试剂的使用，但样品前处理较复杂，所用设备价格昂贵，对操作人员的技术要求也比较高，不适合于大批量样本检测及大范围推广的应用。

免疫磁珠分离技术(Immunomagnetic bead-based separation，IMS)是近年来发展起来的一项新的免疫学技术。免疫磁珠(Immunomagnetic bead，IMB)既可结合活性蛋白质抗体，又可被磁铁吸引，经过处理后，可将抗体结合在磁珠上，使之成为抗体的载体，磁珠上抗体与特异性抗原物质结合后，则形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，这种复合物在磁力作用下发生力学移动，使复合物与其它物质分离，而达到分离特异性抗原的目的。免疫磁珠(IMB)是一个平台，凡是利用抗原抗体结合原理进行工作的领域都可以应用，并且已在医学和生物学的骨髓移植、分离干细胞、细胞器、癌细胞、激素、病原菌以及毒素等方面取得了显著成绩。近年来IMB以其高度的敏感性和特异性被广泛应用于食品、水、生物样品、环境等标本中真菌毒素的分离和检测工作中，显示出良好的开发应用前景。

在分离真菌毒素方面，IMB可有效地收集、浓缩大量样品中的少量真菌毒素，可避免有机溶剂萃取法、免疫亲和层析法提取时存在的缺点。IMB对目的毒素的富集具有高分离率、高特异性、高稳定性、无污染、无毒性、操作简便、样品用量少且不会破坏毒素结构等优点，与常规方法相比，不需要多加纯化步骤去除杂质，可直接对真菌毒素产生富集分离纯化的效果，并可在2-5h内完成。并且磁珠上偶联的抗体可准确识别真菌毒素上的特征基团，从而减少漏检，减少安全隐患。

目前，虽有利用免疫磁珠富集分离黄曲霉毒素、T-2毒素的报道，但是免疫磁珠在赭曲霉毒素A上的应用却未见报道。本发明利用磁珠与抗体的偶联原理对可富集赭曲霉毒素A的免疫磁珠的制备工艺及应用条件进行了优化，大大提高了对赭曲霉毒素A的富集能力和检测灵敏度，同时凭借免疫磁珠自身的快速方便、价格低廉的特点，将其应用于谷物及饲料中赭曲霉毒素A的分离与富集，可以进一步提高快速检测赭曲霉毒素A的效率。

发明内容

本发明的目的是为了弥补现有技术存在的不足，提供一种用于赭曲霉毒素A富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用，以解决赭曲霉毒素A样品净化分离操作复杂、分离效率低、存在较大安全隐患的技术问题。

为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案是：提供一种用于赭曲霉毒素A富集净化的免疫磁珠，所述免疫磁珠上偶联有赭曲霉毒素A单克隆抗体；所述赭曲霉毒素A单克隆抗体是用赭曲霉毒素A人工抗原免疫白鼠所得到的；所述赭曲霉毒素A人工抗原是赭曲霉毒素A半抗原与载体蛋白的偶联物，其分子结构式如式Ⅰ所示：

所述赭曲霉毒素A人工抗原是按照如下方法制备得到的：