[发明专利]用于在马克思克鲁维酵母营养缺陷型菌株中进行外源基因分泌表达的重组载体

说明书

技术领域

本发明涉及一种分泌表达重组载体，尤其涉及一种应用于在马克思克鲁维酵母营养缺陷型菌株中进行外源基因表达的重组表达载体。

背景技术

酵母是单细胞的真核生物，它兼具微生物的特性和真核生物的蛋白合成加工系统。因此，它被广泛的用于表达多种外源真核蛋白。目前主流的酵母表达系统包括毕赤酵母和酿酒酵母表达系统。但是，毕赤酵母的蛋白表达需要用甲醇诱导，不适合用于食用蛋白的生产。酿酒酵母易产乙醇，生长密度低，表达水平偏低。针对这一系列问题，发展新型的安全性高和产量高的酵母表达系统具有很高的工业价值。

马克思克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)已经通过了美国和欧洲的GRAS和QPS安全认证，其自身不仅被认为是安全的微生物菌株，同时也被认为是可用于制备食品级重组蛋白(酶)的安全微生物菌株，是一种被欧盟认可的食品级的酵母。它具有营养要求极其简单、生长旺盛、生物量大、生长温度适应范围广等特点。同时，它还具有高效分泌蛋白的特点。因此，马克思克鲁维酵母具有高效表达食用和饲用蛋白的巨大潜力。

表达系统由宿主菌和表达载体构成。对于食品安全级别的酵母表达系统，宿主菌通常选用营养缺陷型标记。

发明内容

本发明提供了一种可用于在营养缺陷型菌株中进行外源基因分泌表达的重组载体。

本发明第一个方面是提供一种用于在马克思克鲁维酵母营养缺陷型菌株中进行外源基因分泌表达的重组载体，按照顺序包括氨苄抗性基因、PKD1载体、菊粉酶启动子、信号肽、多克隆位点、菊粉酶终止子、营养基因启动子、营养基因开放阅读框(ORF)。

其中，所述信号肽优选为菊粉酶信号肽、或酵母alpha因子信号肽中的任意一种或几种。

其中，所述营养基因优选为马克斯克鲁维菌株的营养基因，如URA3基因、HIS3基因、ADE2基因中的任意一种或几种，更优选为URA3基因。

其中，所述多克隆位点可以是包括一个或多个位点限制性酶切位点的序列，所述限制性酶切位点如SmaI、XmaI、SpeI、NotI中的任意一种或几种，更优选为SpeI、NotI、以及SmaI和/或XmaI中的任意一种或几种，如SmaI/XmaI、SpeI、NotI。

其中，所述多克隆位点长度优选为15-25bp，更优选为18-23bp，更优选为19-21bp。

在本发明的一种优选实施例中，所述重组载体的DNA序列如SEQIDNo.1所示。

在本发明的一种优选实施例中，所述重组载体的DNA序列如SEQIDNo.2所示。

本发明第二个方面是提供一种构建上述重组载体的方法包括：

扩增pUC19质粒、PKD1载体，获得pUC19与PKD1连接的片段I；

扩增马克思克鲁维酵母基因组，获得包含营养基因启动子或ORF的片段II；

扩增马克思克鲁维酵母基因组，获得包含菊粉酶基因启动子、菊粉酶信号肽、和部分多克隆位点的片段III；

扩增马克思克鲁维酵母基因组，获得包含菊粉酶终止子和部分多克隆位点的片段IV，

将片段I、II、III、IV进行连接，获得重组载体。

其中，扩增pUC19质粒的引物优选为：

正向引物：

5'-GAGGGGTACCGAGCTCGAATTAGCTCGAATTCGTAATCATGTCATAGCTGTTTCCT-3'；

反向引物：

5'-TACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCT-3'。

其中，扩增PKD1质粒的引物优选为：

正向引物：

5'-CCAAGCTTGCATGCATCACTAATGAAAAGCATACGACGCC-3'；

反向引物：

5'-AATTCGAGCTCGGTACCCCTCCGTTGCAGCGTGCGAATCGGCACGG-3'。

其中，在一种优选实施例中，获得pUC19与PKD1连接的片段I方法如下：扩增pUC19质粒得到A片段，扩增Gateway系统载体的pcYGW获得B片段，扩增PKD1载体获得C片段，将A、B和C片段连接，将连接得到的质粒进行扩增，得到包括pUC19与PKD1的片段I。

其中，扩增pcYGW所用引物优选为：