[发明专利]一种黑色素细胞的培养方法有效
申请号: | 201510563152.7 | 申请日: | 2015-09-07 |
公开(公告)号: | CN105112355B | 公开(公告)日: | 2019-03-19 |
发明(设计)人: | 罗卫;李明;刁云珍;徐印祥 | 申请(专利权)人: | 北京艾美特夫生物科技有限公司 |
主分类号: | C12N5/071 | 分类号: | C12N5/071 |
代理公司: | 北京慕达星云知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 11465 | 代理人: | 李冉 |
地址: | 102206 北京市昌平区生*** | 国省代码: | 北京;11 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 黑色素 细胞 培养 方法 | ||
1.一种黑色素细胞的培养方法,其特征在于,包括在黑色素细胞增殖培养之前先进行预培养2-4h,预培养的接种密度为2-10×104个细胞/cm2;所述预培养基为:
DMEM培养基与Ham's F-12培养基按体积比2-4:1混合;
腺嘌呤1.6-2.0×10-4M;
青霉素80-100单位/mL;
链霉素80-120μg/mL;
氢化可的松0.1-0.5μg/mL;
胰岛素2-6μg/mL;
表皮生长因子5-12ng/mL;
霍乱毒素0.8-1.5×10-10M;
胎牛血清4-7%;
在预培养之前还包括:将离体的表皮用分解混合酶进行消化培养0.5-2小时,终止消化后,过滤、离心,然后接种预培养基进行预培养;所述分解混合酶为胰蛋白酶和I型胶原酶;
预培养后,去掉预培养基,然后将贴壁后的细胞转移到增殖培养基,所述增殖培养基为M2培养基;
所述增殖培养的方法为:每周换液3次,当细胞达到70-80%饱和后,对黑色素细胞进行消化,回收,重悬,播种进行扩增传代;
对黑色素细胞进行消化的方法为:将1g/L胰蛋白酶·0.152g/L EDTA溶液加入到培养基中,孵育3-5min,终止消化;
所述播种的密度为5-10×103个细胞/cm2。
2.根据权利要求1所述的黑色素细胞的培养方法,其特征在于,所述预培养基为:DMEM培养基与Ham's F-12培养基按体积比3:1混合;
腺嘌呤1.8×10-4M;
青霉素100单位/mL;
链霉素100μg/mL;
氢化可的松0.4μg/mL;
胰岛素5μg/mL;
表皮生长因子10ng/mL;
霍乱毒素1.2×10-10M;
胎牛血清5%。
3.一种黑色素细胞悬液制剂的制备方法,其特征在于,将利用权利要求1-2任一项所述的培养方法培养传代3-4代后的黑色素细胞消化、离心,用不含抗生素的M2培养基重悬细胞。
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