[发明专利]一种黑色素细胞的培养方法

说明书

本发明公开了一种黑色素细胞的培养方法。该方法包括在黑色素细胞增殖培养之前先进行预培养2‑4h，所述预培养基为：DMEM培养基与Ham's F‑12培养基按体积比2‑4:1混合；腺嘌呤1.6‑2.0×10^‑4M；青霉素80‑100单位/mL；链霉素80‑100μg/mL；氢化可的松0.1‑0.5μg/mL；胰岛素2‑6μg/mL；表皮生长因子5‑12ng/mL；霍乱毒素0.8‑1.5×10^‑10M；胎牛血清4‑7％。上述方法中的预培养，促进了黑色素细胞贴壁，提高了黑色素细胞所占比例和细胞活性。传代后从最初的黑色素细胞占1％，最高提高到了90％，并且黑色素细胞形态和功能及遗传性状稳定。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种黑色素细胞的培养方法。

背景技术

白癜风是由于皮肤和毛囊的黑色素细胞(melanocyte，MC)内酪氨酸系统的功能减退、丧失引起的一种以局限性或泛发性色素脱失为特征的皮肤粘膜疾病。黑色素细胞位于表皮的基底层，与表皮细胞共同组成表皮黑素单位,其主要功能是产生黑素小体保护皮肤免受损害。

白癜风患者皮损部位的黑色素细胞变化过程是由早期功能失活到晚期缺失，基于这一病理变化，有效治疗的原理是将自身的黑色素细胞从健康皮肤移植到无黑色素细胞的白斑区，并在移植后成活产生黑素。这一治疗原理是临床中白癜风移植治疗的依据,在移植治疗中,黑色素细胞混悬液移植法为有效手段之一，治愈率达90％以上，其过程为：以非培养或培养的方式制备黑色素细胞悬液，然后将黑色素细胞悬液以700-1000/mm²密度移植到受皮区。

由于黑色素细胞仅占表皮细胞数量的1％左右，而且其生长缓慢，增殖能力极为有限，所以如何在培养过程中去除角质形成细胞是黑色素细胞培养的重点，同时黑色素细胞在培养过程中极易被成纤维细胞污染，有时即使混入了极少量的成纤维细胞也会导致培养的失败。现有技术中，采用既能促进黑色素细胞生长又能抑制角质形成细胞TPA(12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate)和霍乱毒素基本上解决了上述问题。但是TPA具有潜在的促肿瘤作用，从而使上述培养方法在临床上受到了限制。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和二丁酰环腺苷酸(dbcAMP)作为添加剂替代TPA进行原代培养则解决了上述技术问题，该技术可以使促进黑色素细胞生长，并且规避了TPA具有潜在的促肿瘤的风险。一旦发生了成纤维细胞的混杂,一般情况下采用加入G418等有丝分裂细胞抑制剂、降低钙离子浓度或机械刮除等方法以去除成纤维细胞，但是大多数方法不仅达不到完全除去成纤维细胞的效果,更在抑制成纤维细胞的同时也影响了黑色素细胞的生长。

利用上述方法培养的黑色素细胞，占表皮细胞的比例不高，总数有限，分化活性不高，不能满足临床需要。

发明内容

为了解决现有技术黑色素细胞培养中黑色素细胞的比例和总数不高，增殖和分化活性低的问题，提供一种可以产生高比例、高分化活性的黑色素细胞的培养方法。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种黑色素细胞的培养方法，包括在黑色素细胞增殖培养之前先进行预培养2-4h，所述预培养基为：

DMEM培养基与Ham's F-12培养基按体积比2-4:1混合；

腺嘌呤 1.6-2.0×10^-4M；

青霉素 80-100单位/mL；

链霉素 80-120μg/mL；

氢化可的松 0.1-0.5μg/mL；

胰岛素 2-6μg/mL；

表皮生长因子 5-12ng/mL；

霍乱毒素 0.8-1.5×10^-10M；