[发明专利]番茄晚疫病菌PCR检测引物、试剂盒及检测方法

说明书

本发明提供了番茄晚疫病菌PCR检测的引物、试剂盒及方法，所述引物包括上游引物PIF：5'‑GCCATGTCCGGTATTACCAC‑3'和下游引物PIR：5'‑GCTCATCTTCAGACCCTTGG‑3'。使用本发明的PCR检测引物、试剂盒及方法，可在晚疫病菌纯DNA、发病番茄植物组织及带菌的土壤样品中特异性地扩增出片段大小为399bp的扩增产物。本发明具有准确性高、特异性强、灵敏度高、检测过程操作简便快速等优点，可用于田间番茄晚疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，对番茄晚疫病的及时有效防治具有重要意义。

技术领域

本发明涉及番茄晚疫病菌特异性PCR检测引物、试剂盒及其检测方法，专用于番茄晚疫病菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于田间番茄晚疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。

背景技术

番茄是全球广泛种植，高消费量的蔬菜作物之一，中国是番茄出口大国，在南北均有大面积栽培。番茄果实营养极为丰富，品种类型较多，既能作为水果生食，也能作蔬菜成为餐桌上的美味佳肴，还能被加工成番茄酱、番茄汁等功能性罐装食品，为消费市场创造了良好的经济效益。随着栽培技术的进步，近年来主要通过保护地栽培模式生产番茄供应市场，优良的生长环境一方面延长了番茄的生长周期，促进了番茄生产，另一方面却滋生番茄病害的发生，破坏番茄植株的生长，威胁番茄的产量及品质甚至在采后储藏期造成危害。其中，由晚疫病菌(Phytophthora infestans)侵染引起的番茄晚疫病是番茄生产上发生最普遍、危害最严重的病害之一；无论在露地还是保护地都造成重大损失，是一种流行性很强的毁灭性病害，一般年份减产20%-30%，严重时可达40%-60%，甚至绝收。番茄晚疫病常与番茄其它病害（如灰霉病、早疫病）混合发生，而且发病初期症状具一定的相似性，常给病害的正确诊断造成极大的困难，在生产中常因病害诊断不准确，未能达到实施“对症下药”的正确防治措施而致使病害造成惨重损失的现象时有发生。因此建立番茄晚疫病菌快速检测体系，在发病初期或症状显现之前对植株是否携带晚疫病菌进行快速准确的检测，这对于病害的准确预测预报、制定适时有效的防治措施、控制病害的传播和流行（蔓延）以及减少病害造成的经济损失都具有重要的理论和实际意义。

植物病原菌传统的检测方法是采用选择性培养基从土壤、植物组织或水体中分离菌株，再对这些菌株的形态等进行鉴定，来确定是否存在病原菌，或者用肉眼和借助显微镜技术对发病症状进行判定。传统的检测方法不仅费时、准确度低，而且要求检测人员要有丰富的经验，最重要一点是易遗漏潜育期或隐症的病害，以致延误病害的防治，导致病害的暴发，因此传统病原学检测方法已不能满足现代植物病理学研究的需要。

随着分子生物学技术的发展，应用PCR技术对病原菌进行特异、灵敏的快速分子检测的成功例子已越来越多。国内外已有学者利用rDNA/ITS序列设计特异引物来对植物病原菌进行快速检测、鉴定。然而疫霉属卵菌的分子检测技术研究结果表明，rDNA/ITS在疫霉属的近缘种之间变化很小，从ITS序列上设计引物很难将两个相似高的种区分开。因此要对疫霉属病原菌进行高灵敏性和特异性检测，应从疫霉菌其它基因上设计引物进行检测。目前用于疫霉菌分子检测的靶标基因主要有elicitin 基因、Ras家族相关的Ypt1编码基因、线粒体Cox1和Cox2编码基因以及可能编码储存蛋白的Lpv基因等。

本发明旨在寻找番茄晚疫病菌中新的分子检测靶标基因。β-tubulin是真核生物看家（管家）基因之一，广泛存在于真核生物中，在真核生物进化上非常保守，目前尚无针对该靶标基因进行晚疫病菌分子检测的报道。

发明内容

本发明的目的是提供了一种可快速、准确地检测番茄晚疫病菌的PCR引物、包含该引物的检测试剂盒及检测方法，利用该引物及检测方法检测番茄晚疫病菌准确性高、特异性强、灵敏性高。