[发明专利]一种检测伪狂犬病毒GE基因的LAMP检测方法

权利要求书

1.一种用于快速检测猪伪狂犬病病毒的环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)引物组，所述引物组的序列结构为：

正向外引物(F3)：ACGAGCCCCGCTTCCA

反向外引物(B3)：AGATGCAGGGCTCGTACA

正向内引物(FIP)：AGACCACGCGCGCGGCATCAG-CTTCCACTCGCAGCTCTTCT

反向内引物(BIP)：GAGAACTTCACCGCCACGCT-CGTAGTACAGCAGGCACCG。

2.根据权利要求1所述的LAMP引物，其特征在于，所述引物具有高度特异性，有效扩增猪伪狂犬病毒基因的扩增模板DNA浓度为10～10¹⁰个拷贝数/每ul。

3.权利要求1所述的LAMP引物组在制备检测猪伪狂犬病毒的试剂盒中的应用。

4.由权利要求1所述的LAMP引物组制备的检测猪伪狂犬病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：

(1)所述的LAMP引物组；

(2)扩增靶标DNA所需必要的扩增制剂，所述的扩增制剂包括但不限于，DNA聚合酶，DNTP，以及用于DNA扩增的盐溶液；

(3)用于检测所需的检测制剂，所述的检测制剂优选为，核酸荧光显色剂。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的检测应用包括如下步骤：

步骤(1)提取病料血清中的病毒DNA；

步骤(2)使用所述LAMP引物在LAMP反应体系中扩增病毒DNA；

步骤(3)LAMP反应结果检测。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，

所述的步骤(1)的具体方法为：

1)取病料血清500μL于1.5mL离心管。向离心管中加入10％SDS溶液50μL，而后加入蛋白酶K(20mg/mL)10μL，混匀后置56℃水浴1.5-2h。

2)加入200μLTris平衡酚，充分混匀溶液，置高速离心机中4℃12000rpm离心15min。

3)取上清液于一新1.5mL离心管中，加入Tris平衡酚和氯仿各200μL，充分混匀，4℃12000rpm离心15min。

4)取上清液于一新离心管中，加入氯仿200μL，充分混匀，4℃12000rpm离心15min。

5)取上清液于一新离心管中，加入2倍上清液体积的已-20℃预冷的无水乙醇，于冰箱-20℃静置20min后，4℃12000rpm离心15min，弃掉上清液，此时会发现管底附着有透明粘性沉淀。

6)向离心管中加入1mL70％乙醇冲洗沉淀表面和管壁，4℃7500rpm离心5min，弃掉乙醇，用吸水纸吸走余下液体。

7)加入20μL灭菌水将沉淀溶解，置于-20℃保存备用；

所述步骤(2)的具体方法为：

(1)25μL的LAMP反应体系成分如下：

1)BstDNA聚合酶(8U/μL)，1ul；

2)10×ThermoPol缓冲液(100mMKCl,100mM(NH₄)SO₄,200mMTris-HCl,20mMMgSO₄,1％TritonX-100)，2.5ul；

3)步骤(1)获得的DNA样品，2ul；

4)MgSO₄(100nmol/μL)，1ul、Betaine(5μmol/μL)，5ul；

5)dNTP(25mmol/μL)，5ul；

6)BIP&FIP引物(40uM)，2ul、F3&B3引物(10uM)，0.25ul

7)余量为灭菌超纯水。

(2)反应温度控制在65℃，扩增40-60min，80℃5min终止反应；

所述步骤(3)的具体方法为：

1)琼脂糖凝胶电泳、或2)SYBRGreenI染色法、或3)瞬时离心法；

所述的琼脂糖凝胶电泳法为：

取5μL扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶中电泳，置凝胶成像系统下观察结果条带；

所述的SYBRGreenI染色法为：

向反应管中加入1μLSYBRGreenI核酸染料，观察溶液颜色变化；

所述的瞬时离心法为：

在反应结束后进行瞬时离心，通过有无沉淀判断反应结果。

7.根据权利要求4至6任一所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒用于检测目标病料中的伪狂犬病毒。