[发明专利]一种检测伪狂犬病毒GE基因的LAMP检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体而言，本发明涉及一种检测伪狂犬病毒gE基因的LAMP检测方法。

背景技术

伪狂犬病毒(PseudorabiesVirus，PRV)属于疱疹病毒科，甲型疱疹病毒亚科，猪疱疹病毒Ⅰ型，线状双股DNA病毒。PRV对外界环境的抵抗力较强，在55℃50min、80℃3min或100℃瞬间才能将其杀灭。PRV能感染多种动物，其中，猪是PRV的主要贮存宿主及疫源动物。猪伪狂犬病毒通常引起妊娠母猪繁殖功能障碍和初生仔猪神经症状，仔猪感染率和死亡率可高达100％。近年来，已有50多个国家相继报道了该病的发生，有分析表明该病的流行在全球呈上升趋势。目前，我国也有多个省份的猪场发现了由PRV引起的一系列疾病，这对我国养猪业造成了巨大的经济损失。随着规模化养猪的不断发展和强毒株的出现，PRV的流行日益严重，因此，对PRV快速而又准确的检测对进一步开展伪狂犬病毒的致病性、疫苗免疫、诊断及分子生物学等研究具有重大意义。

目前，对PRV的抗原检测主要依赖聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction,PCR)，抗体检测主要依赖酶联免疫吸附试验(ELISA)。PCR反应和ELISA试验是检测伪狂犬病毒的常规方法，也是目前基层普遍使用的方法。

PCR反应一种分子生物学技术，通过它可以在体外2-3小时内，把少至几拷贝的特定模板DNA扩增到原先的几百万倍。其原理是先将双链DNA解链为单链，引物遂与之结合，根据碱基互补原则向下延伸，即可复制得到两分子拷贝，如此不断循环下去。PCR不仅可以用于基因克隆和序列分析，因为它扩增放大的特点，在疾病诊断中也得到广泛应用。这项对分子生物学意义重大的技术1983年由Mullis发明，经过几十年的发展，已成为实验室最常规有效的实用技术。只是，PCR必须依靠昂贵的仪器才能得以实施，整个循环过程耗时数小时，这对于许多条件受限的基层养殖户是难以承受的，同时也无法满足快速诊断的需要。

ELISA试验是基于免疫酶技术发展起来的，一种对于受检标本的抗原或抗体进行定性和定量分析的生物技术。同样地，ELISA技术也存在操作复杂、耗时长等缺点，难以在基层养殖户推广。

2000年，Notomi等^[1]研发出一种新型核酸扩增技术——环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)。LAMP是一种可对核酸进行高效扩增并广泛应用于疫病快速检测的新型检测方法，它是在具有链置换活性的BstDNA聚合酶作用下，利用能识别目的基因上6个独立区段的4条引物，即正向内侧引物(forwardinnerprimer,FIP)、正向外侧引物(forwardouterprimer,F3)、反向内侧引物(backwardinnerprimer,BIP)、反向外侧引物(backwardouterprimer,B3)，在60～65℃等温条件下高效特异地扩增目的基因。2002年，Nagamine^[2]等在此基础上添加了2条环状引物：上游环状引物(LF)和下游环状引物(LB)，环引物的增加提高了反应速度，缩短了反应时间。应用LAMP技术，只需在60～65℃等温条件下水浴60min即可完成目的基因的扩增。与PCR相比，LAMP拥有诸多优势，特别是整个检测过程仅需要水浴锅、紫外灯这类简单的设备，适合现场使用，且检测时间也大大缩短。

本研究选择提取临床样本DNA，目的是为了更好的切合实际，满足养殖户的实际需要，对日后在基层中的实际推广有着重大的意义。

发明内容

本发明首先涉及一种用于快速检测猪伪狂犬病病毒的环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)引物组，所述引物组的序列结构为：

正向外引物(F3)：ACGAGCCCCGCTTCCA

反向外引物(B3)：AGATGCAGGGCTCGTACA

正向内引物(FIP)：AGACCACGCGCGCGGCATCAG-CTTCCACTCGCAGCTCTTCT

反向内引物(BIP)：GAGAACTTCACCGCCACGCT-CGTAGTACAGCAGGCACCG。

所述的LAMP引物具有高度特异性，能够在扩增模板DNA浓度为10～10¹⁰个拷贝数/每ul时，有效扩增猪伪狂犬病毒基因。

本发明还涉及所述的LAMP引物组在制备检测猪伪狂犬病毒的试剂盒中的应用。