[发明专利]一种棘腹蛙感染腐败希瓦氏菌的PCR检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种检测棘腹蛙感染腐败希瓦氏菌的PCR检测试剂盒，包括2倍反应混合缓冲液、Taq酶、上游引物S‐F：5’–CCCCTATCCTTATTTGCC–3’和下游引物S‐R：5’–CTAGCGATTCCGACTTCAT–3’。

2.如权利要求1所述的检测试剂盒，还包含阳性对照液和阴性对照液。

3.如权利要求2所述的检测试剂盒，还包含灭菌的ddH₂O。

4.如权利要求1或2所述的检测试剂盒，所述2倍反应混合缓冲液1.0mL，包含以下成分：

5.如权利要求1或2所述的检测试剂盒，所述上游引物S‐F和下游引物S‐R的浓度各为10μM/L。

6.权利要求1或2所述的检测试剂盒，所述Taq酶为5U/μLTaq酶。

7.权利要求1或2所述的检测试剂盒，所述阳性对照液为感染腐败希瓦氏菌的棘腹蛙的基因组DNA；所述阴性对照液为ddH₂O。

8.一种采用权利要求1或2所述的试剂盒检测棘腹蛙感染腐败希瓦氏菌的方法，包括以下步骤：

(1)棘腹蛙DNA的提取：

①取病蛙眼、口腔或胃，剪碎后置于匀浆器中，加入匀浆液后冰浴研磨，研磨碎裂后置离心管中；

②加入1％‐3％的β‐巯基乙醇溶液，混匀后60‐70℃水浴0.5‐1h，每隔3‐5分钟取出摇匀一次；

③10000‐15000rpm离心3‐7min，离心后，移出上清液液于另一无菌离心管中，弃沉淀；

④向上清液中加入等体积的按体积比20‐30：1的氯仿：异戊醇的混合溶剂，混匀后，8000‐12000rpm离心5‐15min，取上清液至另一无菌离心管中；

⑤加入等体积的氯仿，混匀后8000‐12000rpm离心5‐15min，再取上清液；

⑥向上清液中加入0.8‐1.2倍体积的2‐4MNaAc溶液，混匀后再加入1.5‐2.5倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀后‐18℃以下放置30min以上；

⑦10000‐15000rpm离心3‐7min，弃上清液，所得DNA沉淀在室温下晾干；

⑧用70‐80％的乙醇对DNA沉淀进行洗涤，干燥后沉淀溶于TE中，加RNaseA，37℃消化20‐40min，得到棘腹蛙DNA后于‐20℃保存。

(2)PCR反应体系：采用20μL的PCR反应体系，在0.2mLPCR反应管内分别加入2倍反应混合缓冲液10μL，上游引物、下游引物各0.5μL，5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL，DNA模板1.0μL，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒，置于PCR反应仪上反应；

(3)PCR扩增产物的检测：PCR反应结束后，取10μL产物在1％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5μg/mL)上，使用0.5×TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小；

(4)结果与判定：在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在237bp处出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为腐败希瓦氏菌阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无目的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的腐败希瓦氏菌。

9.如权利要求7所述的方法，所述PCR反应体系，其PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；然后95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环30次；72℃延伸7分钟，最后4℃保存。