[发明专利]一种棘腹蛙感染腐败希瓦氏菌的PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于一种生物工程技术和生物医学领域，具体涉及一种检测棘腹蛙感染腐败希瓦氏菌的检测试剂盒及检测方法，适用于棘腹蛙的感染腐败希瓦氏菌的检测。

背景技术

棘腹蛙是一种营养丰富且具药用价值的大型山区食用蛙，其鲜肉干样中蛋白质含量为16.25％、脂肪含量为1.26％，具有丰富的滋补功效和药用价值，随着人民生活水平的不断提高，棘腹蛙的食用价值也在逐渐上升，具有较好的开发前景。同时作为脊椎动物进化中的过渡动物，是进行解剖学、遗传学和胚胎发育学研究较为理想的实验动物。由于环境污染严重、野生栖息地遭受破坏、人类大肆捕杀等因素造成棘腹蛙野生种群数量大量减少；为保护其野生资源，同时满足市场需求，棘腹蛙的人工养殖逐渐受到重视。但是，随着养殖数量的不断增多，随之而来的多种病害对棘腹蛙养殖产业的发展产生严重威胁。感染蛙类的病原菌主要有温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、链球菌等，可见棘腹蛙细菌性疾病是人工养殖过程中常见且危害极大的一类疾病，对细菌性疾病的研究也是棘腹蛙人工养殖的一个重点。目前还没有检测棘腹蛙感染腐败希瓦氏菌的报道。

腐败希瓦氏菌在分类上属于不动杆菌属，是一种条件致病菌，一般在养殖环境恶化、养殖种类体质下降等情况下才导致疾病发生；该菌株可导致水生动物肠道腐败、体表溃疡、体内组织发生败血性病变。近年来，国内外有大量关于水生动物腐败希瓦菌的报道，在鲤鱼、虹鳟、大黄鱼和大菱鲆上都有分离出并确定为优势菌株。由此可见，腐败希瓦氏菌给水产养殖产业带来了巨大伤害。为了及早发现棘腹蛙是否被腐败希瓦氏菌感染，有必要建立一种快速、准确、灵敏的检测方法。

CN102382888公开一种腐败希瓦氏菌的免疫磁珠-FQ-PCR检测方法，其特征在于包括下述步骤：1)、抗体制备：将浓度为109cfu/mL的腐败希瓦氏菌液0.20mL注射于小鼠腹腔内首次免疫，间隔一周相同剂量的腐败希瓦氏菌液加强免疫一次，共加强免疫三次，每次加强免疫的腐败希瓦氏菌液浓度为1010cfu/mL，最后一次加强免疫后第四天，摘除小鼠眼球取血，血液置于37℃下温育0.5h，4℃下3000r/min离心15min，取上清，得到腐败希瓦氏菌抗体溶液；2)、免疫磁珠制备：取48mg的Fe3O4磁珠先后用乙醇和双蒸水超声清洗干净，用双蒸水定容至20mL得磁珠溶液，在10mL磁珠溶液中，加入质量浓度为10％戊二醛溶液2mL，室温下搅拌3h，固液分离后用磷酸吐温缓冲液清洗磁珠，所述磷酸吐温缓冲液中由磷酸缓冲液与吐温20配制而成，所述磷酸吐温缓冲液中所述吐温20的体积百分浓度为0.03～0.07％，再将清洗后的磁珠悬浮于2mL磷酸缓冲液中，所述磷酸缓冲液的pH为7～7.5，然后加入50μL上述腐败希瓦氏菌抗体溶液，4℃下轻轻搅拌12h，得到腐败希瓦氏菌免疫磁珠溶液，4℃保存备用；3)、待测样品富集：在盛有0.1mL的上述腐败希瓦氏菌免疫磁珠溶液中加入1mL待测样品液，室温下轻缓旋转振荡30min，将试管置于磁性细胞分离架上3min，移出管中液体，每次用1.0mL上述磷酸缓冲液清洗腐败希瓦氏菌免疫磁珠，重复清洗3-5次，清洗完毕，加入0.5～1mL无菌水，磁性分离，取出腐败希瓦氏菌免疫磁珠后，得到富集的待检样品溶液；4)、模板DNA制备：将上述待检样品溶液，在100℃温度下煮沸10min，12000r/min离心5min，取上清，得到模板DNA溶液；5)、PCR反应：取上述模板DNA溶液5μL，加入到由含有荧光染料的TaqTMII混合液10μL、引物浓度为10μM的FQF引物溶液0.5μL、引物浓度为10μM的FQR引物溶液0.5μL的反应体系中，用无菌水定容至20μL，反应程序：95℃预变性5min；94℃变性5s、50℃退火15s、72℃延伸15s，共45个循环；PCR反应中若有荧光信号响应，待检样品溶液含有腐败希瓦氏菌；所述FQF引物溶液含有序列为GTGAAACTCATTTGGGTTGTAT的特有性引物，所述FQR引物溶液含有序列为CCGTTCGGAAATCGTTAG的特有性引物；6)、上述步骤1-5的方法为非诊断疾病的方法