[发明专利]一种酿酒酵母染色体及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种酿酒酵母人工染色体，其包括n个重复重组盒、2个端粒重复序列、2个隔离子序列、着丝粒-自主复制序列和pol30基因；

每个所述重复重组盒由上游重组目标序列、报告基因、筛选标记基因和下游重组目标序列组成；所述报告基因和所述筛选标记基因均位于所述上游重组目标序列和所述下游重组目标序列之间；

所述n为1或2；

所述酿酒酵母人工染色体从上游至下游依次包括一个端粒重复序列、一个隔离子序列、第一个重复重组盒、着丝粒-自主复制序列、pol30基因、第二个重复重组盒、另一个隔离子序列和另一个端粒重复序列；

或所述酿酒酵母人工染色体从上游至下游依次包括一个端粒重复序列、一个隔离子序列、第一个重复重组盒、着丝粒-自主复制序列、pol30基因、另一个隔离子序列和另一个端粒重复序列。

2.根据权利要求1所述的酿酒酵母人工染色体，其特征在于：

所述报告基因为RFP基因；

所述筛选标记基因为TRP1基因；

所述第一个重复重组盒的上游重组目标序列为序列表中序列9；

所述第一个重复重组盒的下游重组目标序列为序列表中序列10；

所述第二个重复重组盒的上游重组目标序列为序列表中序列11；

所述第二个重复重组盒的下游重组目标序列为序列表中序列12；

所述第一个重复重组盒的序列为序列表中序列15；

所述第二个重复重组盒的序列为序列表中序列16。

3.根据权利要求2所述的酿酒酵母人工染色体，其特征在于：

所述端粒重复序列均为序列表中序列1；

所述隔离子序列均为序列表中序列2；

所述着丝粒-自主复制序列为序列表中序列4；

所述pol30基因序列为序列表中序列6；

所述报告基因为RFP基因；

所述筛选标记基因为TRP1基因。

4.一种酿酒酵母人工染色体的制备方法，为将n个重复重组盒整合到pNEOC14载体中，得到酿酒酵母人工染色体；每个所述重复重组盒由上游重组目标序列、报告基因、筛选标记基因和下游重组目标序列组成；所述报告基因和所述筛选标记基因均位于所述上游重组目标序列和所述下游重组目标序列之间；所述n为1或2。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：将n个重复重组盒转入含有线性化的pNEOC14载体的酿酒酵母中，得到重组菌，提取所述重组菌的质粒，即得到酿酒酵母人工染色体；

所述含有线性化的pNEOC14载体的酿酒酵母为将线性化的pNEOC14载体转入宿主酿酒酵母得到的中间菌；

所述线性化的pNEOC14载体为用限制性内切酶PmeI酶切pNEOC14载体后得到的线性DNA分子；

所述pNEOC14载体的核苷酸序列为序列表中序列7所示的环状DNA分子。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：

所述报告基因为RFP基因；

所述筛选标记基因为TRP1基因；

所述第一个重复重组盒的上游重组目标序列为序列表中序列9；

所述第一个重复重组盒的下游重组目标序列为序列表中序列10；

所述第二个重复重组盒的上游重组目标序列为序列表中序列11；

所述第二个重复重组盒的下游重组目标序列为序列表中序列12；

所述第一个重复重组盒的序列为序列表中序列15所示；

所述第二个重复重组盒的序列为序列表中序列16所示。

7.一种DNA片段，为权利要求1中所述的重复重组盒。

8.含有酿酒酵母人工染色体的酵母菌，为将权利要求1-3中任一所述的酿酒酵母人工染色体导入酿酒酵母中得到的酵母菌。