[发明专利]一种酿酒酵母染色体及其构建方法与应用

说明书

本发明公开一种酿酒酵母染色体及其构建方法与应用。本发明的酿酒酵母染色体包括2个端粒重复序列、2个隔离子序列、着丝粒‑自主复制序列、pol30基因和n个重复重组盒。通过试验证明：本发明的酿酒酵母染色体的营养缺陷型的标记基因少，可以在不进行筛选的情况下进行正常和稳定的生长，不仅提高了外源基因在酵母中的表达量、稳定性和拷贝数，并且可以对整合进入基因组的基因进行增加、筛减乃至扩展新的多基因簇，在酵母内成功实现了beta胡萝卜素和紫色杆菌素的快速外源表达，为多种外源途径的酵母异源生产提供了快速可行的方法，可以满足基因工程、代谢工程及合成生物学领域的应用需求。

技术领域

本发明属于基因工程、代谢工程及合成生物学领域，具体涉及一种酿酒酵母染色体及其构建方法与应用；尤其涉及一种可实现多基因、多代谢通路、可扩展并无需筛选，且稳定存在的酿酒酵母染色体及其构建方法与应用。

背景技术

随着现代生物技术和生物医药的发展，利用外源系统表达及获取高附加值产物的应用越来越普遍。著名的成功案例包括青蒿素的发酵生产等。传统的表达系统是利用微生物如大肠杆菌、枯草杆菌和酿酒酵母等底盘生物，通过放入这些系统中原本不存在的酶基因，从而利用这些系统中原本已经存在的代谢产物，获取所需的目标产物。通过进一步的优化，最终获得较高产量和质量的产品。为了实现外源基因在这些体系中的表达，通常需要将多个基因从其他生物中PCR扩增出来，然后放入宿主细胞内进行表达。常见的将多个外源基因放入宿主系统的方法有：1)将多个基因分别克隆在单独的载体上，然后将各带有外源基因的载体转化进入同一个细胞；2)将多个基因分步克隆到同一个载体上，然后转化进入细胞；3)将多个基因分别转化，整合到宿主基因组中。

早期的代谢工程方法是将所需要表达的基因，利用分子生物学的方法，从该基因的源物种中扩增，并克隆在载体上。如果同时需要表达多个基因，可以采用相同的策略，将各个基因分别克隆到带有不同抗性标记的载体上，每个基因都通过相同或者不同的启动子等生物元件进行调控。然后将构建好的质粒分步、或者共同转化到宿主细胞(通常是大肠杆菌)内，通过对抗性标记的筛选，获得带有这几个外源基因的菌株。

因为可供选择的抗性基因数目有限，所以采用上述方法进行外源基因的表达受到局限。为此，人们又开发了新的方法，即将多个基因，分步克隆到同一个载体上。这样只需要一种抗性载体，就可以同时转入多个基因。利用该方法，人们可以同时表达较大数量的外源基因。

将多个基因克隆在同一个载体上解决了部分因为基因数目的限制，但和单独的载体表达一样，对最后获得菌株必须保持抗性的筛选。一旦筛选压力消失，菌株所携带的外源基因会很快的被丢失掉。而抗生素等的使用，也对极大的提高了工业生产成本。为了获得稳定的表达体系，剔除对抗生素等筛选压力的需求，一个解决办法是将这些外源基因整合到宿主基因组上。但整合到染色体上的一个局限就是能够整合的基因拷贝数低，能够整合的基因数目小，因此产品表达量少，很难满足工业大量生产的目的。

因为大肠杆菌等细菌生长速度快，基因组相对简单，分子操作技术成熟，所以它们很早就被用于各种代谢工程的宿主。与此同时，酿酒酵母作为一种简单的真核微生物，因为其遗传背景清楚，遗传操作方便，被广泛的用作为真核表达系统。此外，酵母被认为是一种安全的微生物，比大肠杆菌等更有利对食品相关等产品的生产。另外，酵母具有一个强大的同源重组系统，可以利用仅仅几十个碱基对的同源序列，进行准确和高效的同源重组，从而可以更为快捷的进行多基因、大片段DNA的组装。

因此，为了提高外源基因在酵母中的表达量、稳定性，可以将它们整合到基因组中，而且必须保证这些基因可以在必要的情况下能够提高拷贝数，并且实现对整合进入基因组的基因进行增加、筛减乃至扩展新的多基因簇。与此同时，必须保证营养缺陷型标记的最少量使用，并且可以在不进行筛选的情况下进行正常和稳定的生长。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种酿酒酵母人工染色体。