[发明专利]毛竹原生质体培养的方法

权利要求书

1.毛竹Phyllostachys edulis原生质体培养的方法，其特征包括：胚性愈伤组织的酶解，原生质体的分离与纯化，原生质体的培养，愈伤组织的分化，以及壮苗、炼苗和移栽过程，具体步骤如下：

(1)胚性愈伤组织的酶解：选择致密淡黄色的毛竹胚性愈伤组织若干，将其放置在愈伤组织增殖培养基上，26℃暗培养7-15d，边缘生长出白色较疏松的胚性愈伤组织，愈伤组织增殖培养基是以MS培养基为基础，添加1-3mg/L的2，4-D、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白、30g/L的葡萄糖、8g/L的琼脂粉；然后将刚长出的白色较疏松的胚性愈伤组织分离，放入装有酶解液的培养皿中，并将培养皿置于70rpm的摇床上进行避光酶解3-5h，酶解液由2％的cellulase、1.5％的macerozyme、0.1％的MES、0.7M的manitol、0.1％的CaCl₂·2H₂O、1％的BSA组成，pH＝5.80

(2)原生质体的分离与纯化：将酶解后的溶液用40μm的细胞筛进行过滤，收集过滤液体，在4℃条件下设100-200g离心10-15min，小心倒掉上清液，加入4℃预冷的改良MS培养液使原生质体重新悬浮，然后再离心，如此反复3-4次直至酶解液完全洗净，最后将洗净后的原生质体用4℃预冷的MS培养液悬浮保存；改良MS培养液是以MS培养基为基础，添加10g/L的甘露醇、5g/L的山梨醇、10g/L的葡萄糖、20g/L的蔗糖；

(3)原生质体的培养：将原生质体悬浮液小心地吸取混合到原生质体培养基上，调整密度为1-20×10⁵个/ml，26℃黑暗培养10-20d，期间每隔24h观测原生质体的生长状况，直至原生质体再生细胞壁，继而形成愈伤组织；原生质体培养基是以MS培养基为基础，添加10g/L的甘露醇、5g/L的山梨醇、100mg/L的抗坏血酸、750mg/L的氯化镁、40mg/L的半胱氨酸，40mg/L的天门冬酰胺、500mg/L的脯氨酸、500mg/L的谷氨酰胺、300mg/L的水解酪蛋白、10g/L的葡萄糖、20g/L的蔗糖；

(4)愈伤组织的分化：将原生质体再生的愈伤组织转接到分化培养基上，26℃光培养30-50d，光照时间12h/d，光照强度1000-1500lux，使愈伤组织分化成苗，形成再生植株；分化培养基是以MS培养基为基础，添加0.5-2.0mg/L的ZT、0.5-3.0mg/L的IBA、0.5-2.0mg/L的NAA、30g/L的麦芽糖、8g/L的琼脂；

(5)壮苗、炼苗和移栽：将再生的小植株接种到壮苗培养基上培养30-50d，开瓶炼苗5-10d，取出小苗清洗根部的培养基，再用0.1％的高锰酸钾溶液清洗根部，然后将小苗栽植到灭菌的介质中，遮阴散射光培养一个月后，幼苗成活；壮苗培养基是以MS培养基为基础，添加1-4mg/L的NAA、0.2-0.5mg/L的TDZ、8g/L的琼脂、30g/L的蔗糖。