[发明专利]毛竹原生质体培养的方法

说明书

技术领域

本发明涉及林木生物技术和细胞工程育种领域，特别涉及到毛竹原生质体培养。

背景技术

作为植物细胞工程的重要组成部分，原生质体培养技术兴起于上世纪六七十年代，几十年来被广泛应用于植物的遗传和育种学研究领域。随着基因工程的发展，原生质体系统同时也成为基因表达及细胞内定位的重要工具，在生物技术领域发挥着重要的功能。

1960年，Cocking采用酶法分离原生质体获得成功，提供了一种大量制备有活力的原生质体的方法，开创了植物原生质体培养和细胞杂交的研究领域(参考文献1)。

1971年，Nagata和Takebe从培养的烟草叶肉原生质体获得完整的再生细胞，极大地推动了这方面的研究(参考文献2)；

1972年，Carlson用NaNO₃做融合剂将两种烟草的原生质体融合，培养出世界上第一株体细胞杂种(参考文献3)；

原生质体培养技术的突破，促使人们期望通过体细胞杂交来转移目标性状进而实现植物的遗传改良，成为遗传育种学研究的新手段，随着培养技术的不断进步，原生质体培养技术相继在禾本科植物上取得成功，成为禾本科作物育种的重要途径。

1995年，Spangenberg等通过原生质体培养实现了多花黑麦草与高羊茅的体细胞杂交，将后者的CMS转移到前者(参考文献4)；

1998年，Kisaka et al.获得水稻与大麦的族间体细胞杂种的再生植株并结实(参考文献5)；

2003年，Xia et al.利用小麦与高冰草获得可育杂种植株，并将高冰草的优质、耐盐等目标性状转入小麦(参考文献6)。这些研究工作极大地鼓舞了其他植物的原生质体培养热情，推动着这一繁琐而又复杂的培养体系不断地发展进步。

关于竹类植物原生质体培养的研究，报道甚少。1990年Huang et al.利用蓬莱竹Bambusa multiplex和绿竹Bambusa oldhamii的愈伤组织，在1％的纤维素酶(Cellulysin)、2％的崩溃酶(Driselase)和1％的果胶酶(Pectolysase)上，于12℃、80rmp酶解16h，获得原生质体；然后在附加BSA、arpinine HCl、MES以及0.6M mannitol的培养基上，蓬莱竹原生质体成活率达60％，绿竹达40％，但未见植株再生(参考文献7)。

1994年阙国宁等以Dendrocalamus membranceus茎段为材料诱导出愈伤组织，然后在添加4％纤维素酶(Cellulase)R-10、2％离析酶(Macerozyme)和0.25％果胶酶(Pectinase)的培养基上，在40-50rpm、28℃的黑暗条件下酶解6h，过滤、离心及纯化后获得了活力80％以上的原生质体，其产量达到了每克鲜重2.5×10⁵个原生质体，但未见原生质体继代培养及植株再生(参考文献8)。

竹类植物原生质体培养的滞后，主要归咎于其再生体系的不够完善。竹是无形成层的特殊木本植物，其再生技术不同于普通的木本植物和草本植物，离体再生难度大，尽管国内外已有较多竹子愈伤组织再生的报道，但是多数研究存在重复性差、再生效率低等缺点，特别是制备再生原生质体的最佳材料-胚状体系统匮乏，阻碍了其原生质体培养的研究。虽然同为禾本科植物，但是竹子不如农业作物的经济价值高，因此相应的研究投入和重视度都不够，最终形成了竹类植物几无原生质体成功再生的现状。

鉴于竹类植物由于开花结实习性特殊导致的种质创新困难、育种技术匮乏等问题，本发明提供了毛竹原生质体培养的方法，从而为毛竹的细胞工程、基因工程以及分子生物学的研究提供技术平台，具有一定的理论研究价值，也能推动竹子的种质资源创新工作，具有重要的生产实践意义。

主要参考文献

1.Cocking EC(1960)A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles.1960，Nature 187，962-963；doi：10.1038/187962a0

2.Nagata T，Takebe I(1970)Cell wall regeneration and cell division in isolated tobacco mesophyll protoplasts.Planta，92(4)：301-308