[发明专利]对胰蛋白酶抗性提高的β-1;4-内切木聚糖酶及其制备方法与用途

说明书

本发明公开了一种对胰蛋白酶抗性提高的β‑1,4‑内切木聚糖酶。该酶是由氨基酸序列为SEQ ID NO.1的β‑1,4‑内切木聚糖酶中制造两个氨基酸取代而产生的，对胰蛋白酶抗性更强的β‑1,4‑内切木聚糖酶，所述的氨基酸取代是第68位和101位的取代。本发明通过蛋白质工程技术对XynA分子的关键氨基酸残基进行了改造，提供了一种对胰蛋白酶抗性提高的XynA突变体，其对胰蛋白酶的抗性半衰期比野生型XynA延长了160分钟，其他酶学性质与野生型酶基本一致，该突变体酶可用于做饲料添加剂。

技术领域

本发明涉及β-1,4-内切木聚糖酶，特别涉及到对胰蛋白酶抗性提高的β-1,4- 内切木聚糖酶。

背景技术

木聚糖是半纤维素中含量最丰富的组分之一，在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素，约占细胞干重的35％。广泛存在于农业副产品如玉米芯、麦麸、米糠、秸秆、甘蔗渣等之中，是一种重要的饲料原料。

木聚糖的主链由β-D-木糖残基经β-1,4-糖苷键连接，侧链上连有多种不同类型的取代基，比如主链木糖残基的C-2、C-3位可单独或同时发生乙酰化等，其化学结构见图1。

木聚糖的完全降解需要多种水解酶的共同参与，β-1,4内切木聚糖酶能够以内切方式作用于木聚糖主链产生不同长度的木寡糖和少量的木糖，木聚糖酶是木聚糖降解酶中最关键的酶。

动物对木聚糖的利用是在包括木聚糖酶在内的多种饲料用酶的作用下分解成寡糖和单糖之后吸收。

饲料用酶是在进入养殖动物消化道之后发挥作用的，在消化道中的蛋白酶对饲用酶的分解是影响饲用酶使用效率的重要原因，所以，具有蛋白酶抗性是饲用酶十分重要的性质。

目前，广泛使用的木聚糖酶对胰蛋白酶的抗性都较低，作为饲料用酶，其在动物消化道内受到胰蛋白酶的分解，作用效果受到了明显的影响。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种对胰蛋白酶抗性提高的β-1,4-内切木聚糖酶，它是通过蛋白质工程技术对XynA分子的关键氨基酸残基进行改造后得到的一种对胰蛋白酶抗性提高的XynA突变体，克服作为饲料用酶的木聚糖酶对胰蛋白酶抗性差的缺点，提高木聚糖酶作为饲料用酶的使用效果和价值。

本发明是对β-1,4-内切木聚糖酶的基因(称为XynA基因)进行定点突变。由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中获得的β-1,4-内切木聚糖酶，已经被测序， GENBANK登录号为CP010052.1。该酶的成熟蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

根据本发明所述的一种定点突变改造的XynA，是由氨基酸序列为SEQ ID NO.1的β-1,4-内切木聚糖酶中制造多个氨基酸取代而产生的，对胰蛋白酶抗性提高的β-1,4-内切木聚糖酶，所述的氨基酸取代是第68和101位的取代。

根据本发明所述的定点突变改造的β-1,4-内切木聚糖酶的进一步特征，所述在第68位的氨基酸取代是用谷酰胺取代赖氨酸；在101位的氨基酸取代是用丝氨酸取代精氨酸；所述的定点突变改造的β-1,4-内切木聚糖酶的氨基酸序列为 SEQ ID NO.2。

本发明所述的作用于木聚糖的突变体β-1,4-内切木聚糖酶(XynA^K68Q/R101S)，经人工肠液(pH6.0，1mg/mL胰蛋白酶溶液)处理，其对胰蛋白酶的抗性半衰期比野生型酶延长了160分钟，其他酶学性质与野生型酶基本一致。

进一步地，本发明提供了一种DNA分子，其编码本发明所述的对胰蛋白酶抗性提高的β-1,4-内切木聚糖酶。

优选地，本发明所述的DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

本发明的另一个目的是提供一种载体，其含有本发明所述的DNA分子。