[发明专利]煤制油废水COD降解用菌种驯化试剂盒及驯化方法

权利要求书

1.一种煤制油废水COD降解用菌种驯化试剂盒，其特征在于：它是由富集管、驯化预制管A、驯化预制管B组成；其中：

(一)、富集管：

富集管的制备：

(1)、取牛肉膏0.7-1.0g，蛋白胨0.7-1.0g，磷酸二氢钾1.2-2.0g，磷酸氢二钠1.5-2.5g，用1L水溶解，以上培养基用浓度5％的碳酸钠和5％HCl调pH至7.00-7.50，分装到50ml螺口管中，每支管加入培养基20ml；分装完毕后，将螺口管盖拧松，115℃灭菌25-30min，待灭菌结束并冷却至室温后，从灭菌锅中取出并拧紧管盖，至此基础富集管制备完成；

(2)、取苯酚10-13mg，萘酚2-4mg，喹啉1-2mg，甲醇0.08-0.12ml，丁醇0.08-0.12ml，用100ml无菌水溶解，溶解后在无菌条件下用0.22μm无菌滤膜过滤除菌；过滤除菌完成后，取2ml经过过滤除菌的溶液，0.2-0.3μl煤制柴油，在无菌条件下加入到步骤(1)中的基础富集管中，在高速漩涡震荡器上震荡5-10min，至此富集管制备完成；

(二)、驯化预制管A：

驯化预制管A的制备：

(1)、取牛肉膏0.4-0.7g，蛋白胨0.4-0.7g，丙三醇0.4-0.6ml，磷酸二氢钾1.2-2.0g，磷酸氢二钠1.5-2.5g，用1L水溶解，以上培养基用浓度5％的碳酸钠和5％HCl调pH至7.50-8.00，分装到50ml螺口管中，每支管加入培养基30ml；分装完毕后，将螺口管盖拧松，115℃灭菌25-30min，待灭菌结束并冷却至室温后，从灭菌锅中取出并拧紧管盖，至此基础驯化预制管A制备完成；

(2)、取苯酚18-22mg，萘酚8-12mg，喹啉4-6mg，苯胺4-6mg，吡啶0.4-0.6mg，辛基十二烷醇0.1-0.2mg，用100ml无菌水溶解，溶解后在无菌条件下用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，过滤除菌后的溶液为水添加物A；

(3)、取萘130-170mg，甲苯3-7mg，邻苯二甲酸二丁酯2-3mg，苯并咪唑2-3mg，甲醇0.08-0.12ml，丁醇0.08-0.12ml，用100ml75％乙醇溶解，此溶液为醇添加物A；

(4)、分别取水添加物A3ml，醇添加物A0.012ml，煤制柴油1.0-1.2μl，在无菌条件下装到步骤(1)中的基础驯化预制管A中，在高速漩涡震荡器上震荡5-10min，至此驯化预制管A制备完成；

(三)、驯化预制管B：

驯化预制管B的制备：

(1)、取牛肉膏0.2-0.4g，蛋白胨0.2-0.4g，丙三醇0.6-0.8ml，磷酸二氢钾1.2-2.0g，磷酸氢二钠1.5-2.5g，用1L水溶解，以上培养基用浓度5％的碳酸钠和5％HCl调pH至7.50-8.00，分装到50ml螺口管中，每支管加入培养基30ml；分装完毕后，将螺口管盖拧松，115℃灭菌25-30min，待灭菌结束并冷却至室温后，从灭菌锅中取出并拧紧管盖，至此基础驯化预制管B制备完成；

(2)、取苯酚150-170mg，萘酚18-22mg，喹啉9-12mg，苯胺10-12mg，吡啶0.9-1.2mg，辛基十二烷醇0.4-0.6mg，用100ml无菌水溶解，溶解后在无菌条件下用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，过滤除菌后的溶液为水添加物B；

(3)、取萘540-560mg，甲苯18-22mg，邻苯二甲酸二丁酯8-12mg，苯并咪唑8-12mg，甲醇1.8-2.2ml，丁醇1.8-2.2ml，用100ml75％乙醇溶解，此溶液为醇添加物B；

(4)、分别取水添加物B3ml，醇添加物B0.012ml，煤制柴油3.0-4.0μl，在无菌条件下装到步骤(1)中的基础驯化预制管B中，在高速漩涡震荡器上震荡5-10min，至此驯化预制管B制备完成。

2.一种采用权利要求1所述的煤制油废水COD降解用菌种驯化试剂盒驯化方法，其特征在于：包括以下步骤：

(一)、缺氧阶段驯化：

步骤1、将待驯化样品取1-3ml接种到第1富集管中，将第1富集管的管盖拧紧，平放入摇床28-35℃、150-200rpm震荡培养24-48小时；

步骤2、取经第1富集管培养的样品5ml，接种到第1驯化预制管A中，将第1富集管连同管内剩余样品放入4℃冷藏；

步骤3、将第1驯化预制管A的管盖拧紧，平放入摇床25-30℃、100-150rpm震荡培养24-48小时；培养完成后静置30-60min，取上清液A130ml放入100ml经过灭菌的第1三角瓶中，然后放入4℃留存；取沉淀5ml接种到第2驯化预制管A中继续培养；

步骤4、将第2驯化预制管A的管盖拧紧，平放入摇床25-30℃、100-150rpm震荡培养24-48小时；培养完成后静置30-60min，取上清液A230ml放入100ml经过灭菌的第2三角瓶中，然后放入4℃留存；取沉淀5ml接种到第3驯化预制管A中继续培养；

步骤5、将第3驯化预制管A的管盖拧紧，平放入摇床25-30℃、100-150rpm震荡培养24-48小时；培养完成后静置30-60min，取上清液A330ml放入100ml经过灭菌的第3三角瓶中，然后放入4℃留存；当样品经过步骤4的第3驯化预制管A培养后，取沉淀5ml，接种到第1驯化预制管B中；

步骤6、将步骤5的第1驯化预制管B的管盖拧紧，平放入摇床25-28℃、100-150rpm震荡培养48-72h；培养完成后静置30-60min，取上清液B130ml放入100ml经过灭菌的第4三角瓶中，然后放入4℃留存；取沉淀5ml接种到第2驯化预制管B中继续培养；

步骤7、将步骤6的第2驯化预制管B的管盖拧紧，平放入摇床25-28℃、100-150rpm震荡培养48-72h；培养完成后静置30-60min，取上清液B230ml放入100ml经过灭菌的第5三角瓶中，然后放入4℃留存；取沉淀5ml接种到第3驯化预制管B中继续培养；

步骤8、将步骤7的第3驯化预制管B的管盖拧紧，平放入摇床25-28℃、100-150rpm震荡培养48-72h；培养完成后静置30-60min，取上清液B330ml放入100ml经过灭菌的第6三角瓶中，然后放入4℃留存；当样品经过步骤7的第3驯化预制管B培养后，取沉淀1ml，接种到第2富集管中，将第2富集管的管盖拧紧，平放入摇床28-35℃、150-200rpm震荡培养24-48小时；培养后将第2富集管冷藏或冷冻保存，此驯化后菌种为缺氧驯化菌种；

(二)、好氧阶段驯化：

步骤9、当样品经过步骤5的第3驯化预制管A培养完成后，将冷藏的第1富集管取出并恢复室温；待恢复室温6-10h后，取5ml接种到上清液A3中；

步骤10、将步骤9接种后的上清液A3放入摇床25-28℃、150-200rpm震荡培养24-48小时；培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液A2中继续培养；

步骤11、将步骤10接种后的上清液A2放入摇床25-28℃、150-200rpm震荡培养24-48小时；培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液A1中继续培养；

步骤12、将步骤11接种后的上清液A1放入摇床25-28℃、150-200rpm震荡培养24-48小时；培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，当样品经过上清液A1驯化培养后，取沉淀5ml，接种到上清液B3中；

步骤13、将步骤12接种后的上清液B3入摇床25-28℃、150-200rpm震荡培养48-72小时；培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液B2中继续培养；

步骤14、将步骤13接种后的上清液B2入摇床25-28℃、150-200rpm震荡培养48-72小时；培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，取沉淀5ml接种到上清液B1中继续培养；

步骤15、将步骤14接种后的上清液B1入摇床25-28℃、150-200rpm震荡培养48-72小时；培养完成后静置30-60min，弃掉30ml上清液，当样品经过步骤上清液B1驯化培养后，取沉淀1ml，接种到第3富集管中，将第3富集管的管盖拧紧，平放入摇床28-35℃、150-200rpm震荡培养24-48小时；培养后将第3富集管冷藏或冷冻保存，此驯化后菌种为好氧驯化菌种。