[发明专利]一种百日草脱毒苗的获取方法

权利要求书

1.一种百日草脱毒苗的获取方法，其特征在于：该方法步骤如下：

1）采集百日草嫩叶，脱分化产生愈伤组织；

2）将愈伤组织进行热处理，然后将愈伤组织继续诱导出不定芽，不定芽生根培养成健壮的组培苗；

3）进一步剥离组培苗茎尖，脱分化产生愈伤组织；

4）再次将愈伤组织进行热处理后诱导成苗；

5）随机抽取步骤4）中的组培苗，进行病毒检测，若检测合格即百日草脱毒种苗，若不合格需重复1）到4）步，直到获得合格的百日草脱毒种苗。

2.根据权利要求1所述的百日草脱毒苗的获取方法，其特征在于：该方法的详细步骤如下：

1）采集百日草嫩叶，脱分化产生愈伤组织：

采集生长至现蕾期的健康无病的百日草的嫩叶，自来水洗净，流水冲洗30min，用70%酒精浸泡15s，0.1%升汞内加数滴吐温-20溶液浸泡15min，并用玻璃棒搅动，用无菌水冲洗4-5次，滤纸吸干，用孔直径4mm的打孔器打孔，将打下的叶片接种到愈伤诱导培养基上26-28℃条件下暗培养，15-20天产生愈伤组织；

2）将愈伤组织进行热处理，然后将愈伤组织继续诱导出不定芽，不定芽生根培养成健壮的组培苗：

将愈伤组织转移到培养箱中热处理，切除褐化块段后将愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上光培养，20-30天后愈伤组织分化出不定芽，将再生出来的高度1cm以上的芽转接至生根培养基26-28℃条件下光培养成健壮的组培苗；

3）进一步剥离组培苗茎尖，脱分化产生愈伤组织：

待组培苗生长至5cm-8cm，剥取0.4-0.6cm大小的茎尖生长点接种到茎尖诱导愈伤培养基上，在26-28℃条件下暗培养30-45天，诱导出愈伤组织；

4）再次将愈伤组织进行热处理后诱导成苗：

再次将茎尖愈伤组织进行热处理，切除褐化块段后将愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上，26-28℃条件下光培养20-30天后诱导出不定芽，然后转接入生根培养基，40-50天后可得到百日草幼苗；

5）随机抽取步骤4）中的组培苗，进行病毒检测，若检测合格即百日草脱毒种苗，若不合格需重复1）到4）步，直到获得合格的百日草脱毒种苗：

随机抽取8-10只完成了步骤4）的的百日草叶片，进行RT-PCR反转录病毒检测，若检测合格即百日草脱毒种苗。

3.根据权利要求1或2所述的百日草脱毒苗的获取方法，其特征在于：百日草品种选为芳菲1号、芳菲2号、芳菲3号。

4.根据权利要求1或2所述的百日草脱毒苗的获取方法，其特征在于：步骤1）中用于诱导百日草叶片产生愈伤组织的愈伤诱导培养基为：MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.3g/LCH+3%蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为5.8。

5.根据权利要求1或2所述的百日草脱毒苗的获取方法，其特征在于：步骤2）中将将愈伤组织继续诱导出不定芽的不定芽诱导培养基为：MS+0.5mg/LKT+1.5mg/LBA+0.5mg/LGA+3%蔗糖+7.0g/L琼脂，pH为5.8；所述的生根培养基配方为：1/2MS+0.1mg/LIBA+1.5%蔗糖+7.0g/L琼脂，pH为5.8；所述的将愈伤组织诱导成苗的培养基的光照条件为：光照强度为1500-2000Lux，光周期为14h光/10h暗。

6.根据权利要求1或2所述的百日草脱毒苗的获取方法，其特征在于：步骤2）和步骤4）中热处理方法为：在38℃-42℃高温处理6h-8h、然后26℃-28℃低温处理10h-12h交替进行2-3循环。

7.根据权利要求1或2所述的百日草脱毒苗的获取方法，其特征在于：步骤3）中用于诱导茎尖产生愈伤组织的培养基配方为：MS+2.0mg/L6-BA+1mg/LNAA+0.5mg/LKT+3%蔗糖，pH为5.8。

8.根据权利要求1或2所述的百日草脱毒苗的获取方法，其特征在于：步骤4）中将愈伤组织诱导出不定芽的不定芽诱导培养基配方为：MS+0.5mg/LKT+1.5mg/LBA+0.5mg/LGA+3%蔗糖+7.0g/L琼脂，pH为5.8；生根培养基配方为：1/2MS+0.1mg/LIBA+1.5%蔗糖+7.0g/L琼脂，pH为5.8。