[发明专利]一种百日草脱毒苗的获取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种百日草脱毒苗的获取方法，具体涉及一种通过两次脱分化产生愈伤组织并将愈伤组织热处理后再分化、最终百日草脱毒苗的获取方法，属于农业科学技术领域。

背景技术

百日草，菊科，百日草属，原产北美、墨西哥及南美等地，因节节升高，花越开越繁茂，获诸多美名，如状元红、火球花、百日菊、步步高等。百日草喜温暖，不耐寒，耐干旱，宜阳光充足，在长日照条件下舌状花增多。百日草花期长，花量大，每株自初花至霜冻开30-40朵。优良品种多为千层瓣，花色极其丰富，为夏秋季花坛常用花卉，百日草花姿十分优美，色彩鲜艳多变，深受人们喜爱，为阿拉伯联合酋长国国花。墨西哥是百日草的原始产地，对百日草的育种研究也居世界之首，不断向各国推出新品种，成为墨西哥花卉出口的支柱产业。百日草在我国南北方也广泛栽培，有“庶民之花”的美称，为绿化主栽品种之一。

目前我国已成为世界上最大的花卉种子潜在消费市场，草花种子每年的销售量都以20%的增幅上升。百日草虽然在我国各大中城市普遍栽培，但百日草种子几乎被美国公司所控制，种子依赖国外进口，且价格昂贵，而进口种子为F1代，后代易出现形、色分离的情况，而采用分株繁殖每株每年仅可分出5-6个新株，无法满足产业化生产的要求，并且一直用分株繁殖，容易使病毒逐代积累，从而造成百日草品种退化严重。

组织培养技术是有效的解决方案，既可在短期内大量生产优良种苗，也可用于生产脱毒苗，防止种质退化。近年来，国内外相继展开了对百日草组织培养和快速繁殖的研究，研究建立一种既能保持品种优良特性和较高的繁殖系数，又能脱除培养材料中的病毒病原的有效方法，对于防止病毒的进一步扩散，减少种植者的风险具有重要的现实意义。目前很多病毒的存在严重影响了百日草组培苗的生产，因此解决百日草组培苗的完全脱毒问题十分重要。

发明内容

本发明的目的是针对现有百日草脱毒技术存在的不足，提供一种可持续化、易操作且能够规模化生产的百日草脱毒苗的获取方法，该方法解决了现有脱毒技术的脱毒不彻底、操作繁琐的难题，能够满足工厂化脱毒生产的需要。

本发明的目的是通过以下技术方案解决的：

一种百日草脱毒苗的获取方法，其特征在于：该方法步骤如下：

1）采集百日草嫩叶，脱分化产生愈伤组织；

2）将愈伤组织进行热处理，然后将愈伤组织继续诱导出不定芽，不定芽生根培养成健壮的组培苗；

3）进一步剥离组培苗茎尖，脱分化产生愈伤组织；

4）再次将愈伤组织进行热处理后诱导成苗；

5）随机抽取步骤4）中的组培苗，进行病毒检测，若检测合格即百日草脱毒种苗，若不合格需重复1）到4）步，直到获得合格的百日草脱毒种苗。

该方法的详细步骤如下：

1）采集百日草嫩叶，脱分化产生愈伤组织：

采集生长至现蕾期的健康无病的百日草的嫩叶，自来水洗净，流水冲洗30min，用70%酒精浸泡15s，0.1%升汞内加数滴吐温-20溶液浸泡15min，并用玻璃棒搅动，用无菌水冲洗4-5次，滤纸吸干，用孔直径4mm的打孔器打孔，将打下的叶片接种到愈伤诱导培养基上26-28℃条件下暗培养，15-20天产生愈伤组织；

2）将愈伤组织进行热处理，然后将愈伤组织继续诱导出不定芽，不定芽生根培养成健壮的组培苗：

将愈伤组织转移到培养箱中热处理，切除褐化块段后将愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上光培养，20-30天后愈伤组织分化出不定芽，将再生出来的高度1cm以上的芽转接至生根培养基26-28℃条件下光培养成健壮的组培苗；

3）进一步剥离组培苗茎尖，脱分化产生愈伤组织：

待组培苗生长至5cm-8cm，剥取0.4-0.6cm大小的茎尖生长点接种到茎尖诱导愈伤培养基上，在26-28℃条件下暗培养30-45天，诱导出愈伤组织；

4）再次将愈伤组织进行热处理后诱导成苗：

再次将茎尖愈伤组织进行热处理，切除褐化块段后将愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上，26-28℃条件下光培养20-30天后诱导出不定芽，然后转接入生根培养基，40-50天后可得到百日草幼苗；

5）随机抽取步骤4）中的组培苗，进行病毒检测，若检测合格即百日草脱毒种苗，若不合格需重复1）到4）步，直到获得合格的百日草脱毒种苗：

随机抽取8-10只完成了步骤4）的的百日草叶片，进行RT-PCR反转录病毒检测，若检测合格即百日草脱毒种苗。

百日草品种选为芳菲1号、芳菲2号、芳菲3号。