[发明专利]一种高质量薏苡基因组DNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种薏苡基因组DNA提取方法。

背景技术

从植物组织中提取基因组DNA是植物分子生物学研究中的一个基本操作步骤，可应用于文库构建、Southern杂交、分子标记开发和辅助育种等多个方面。DNA质量好坏直接关系到后续实验的成败，经典的基因组DNA提取方法主要为CTAB法和SDS法两种，但研究发现，由于不同植物叶片中所含次生代谢产物的含量和种类存在差异，导致实验中适合一种植物基因组DNA提取的方法并不能在另一种植物基因组DNA提取中获得同样好的效果，因此，分子生物学科学家们根据不同植物组织的特质和研究目的，开发了适合不用植物组织提取基因组DNA的方法，包括改良的CTAB法和SDS法，CTAB-SDS法、高盐低pH法和尿素法等，以期获得产量高、纯度好的基因组DNA。

薏苡是我国传统的药食两用植物，其根、叶和果实均可入药，与目前对薏苡种仁药理学方面开展了较多的研究相比，薏苡分子生物学研究还处于起步阶段，开发一种适合薏苡提取高质量基因组DNA的方法是顺利开展薏苡分子生物学研究的基础。薏苡叶片中生物碱和多糖类物质含量较高，传统的DNA提取方法获得的薏苡DNA含有较多杂质，很难满足包括酶切在内的很多对DNA质量要求较高的实验需求，因此，现有的薏苡DNA提取方法依然在不足。

发明内容

本发明的目的针对现有技术的不足，提供一种可有效去除杂质，DNA得率和纯度都较高的薏苡基因组DNA提取方法。

本发明的技术方案如下：

一种高质量薏苡基因组DNA提取方法，包括如下步骤：取在液氮中充分研磨的薏苡叶片迅速放入提取液中，混匀后置于65℃水浴中30min；冷至室温后加入0.25倍体积无水乙醇和0.11倍体积的5mmol/LKAc溶液，涡旋混匀；加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混合液抽提，低温离心的离心条件温度为4℃，离心转速为12000rpm，离心时间为15min；取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混合液进行第二次抽提，同样离心条件进行离心后获得第二次上清液；将二次离心上清液加入4倍体积CTAB沉淀缓冲液，混匀后室温静置1h，然后4℃离心，离心转速为12000rpm，离心时间为5min；将沉淀溶于400μL1mol/LNaCl溶液中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，絮状沉淀析出后用枪头挑出放于1.5mL离心管中；DNA沉淀用70%乙醇洗涤两次，风干后溶于500μLTE溶液中。

所述的提取液由如下成分组成：浓度2%CTAB，100mmol/LTris-HCl,1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，浓度2%PVP，浓度1%SDS，pH为8.0，提取液使用前加入β-巯基乙醇至终浓度为2%。所述的CTAB沉淀缓冲液由如下成分组成：浓度1%CTAB，100mmol/LTris-HCl,10mmol/LEDTA，pH为8.0。所述的TE溶液由如下成分组成：1mmol/LEDTA，10mmol/LTris-HCl，pH为8.0。

与现有技术相比，本发明的优点是在将植物组织DNA抽提到提取液中后，添加了无水乙醇和高盐KAc溶液的步骤，增强了除去生物碱、多糖、多酚类等杂质的效果。另外，通过离心方式获得第一次DNA沉淀，保证了DNA的得率，将其溶于NaCl溶液后再用无水乙醇进行第二次沉淀，保证了获得DNA的纯度，尤其能满足需要酶切实验操作的研究项目。

附图说明

图1为薏苡叶片DNA的琼脂糖电泳图，图中，1:markerDL2000;2:传统CTAB法提取黔薏苡1号嫩叶DNA,3μL;3:改良CTAB法提取黔薏苡1号嫩叶DNA,3μL;4:改良CTAB法提取黔薏苡1号老叶DNA,3μL;5:改良CTAB法提取兴仁小白壳嫩叶DNA,3μL;6:改良CTAB法提取兴仁小白壳老叶DNA,3μL;7:改良CTAB法提取薏苡新品系嫩叶DNA,3μL。

图2为薏苡品种黔薏1号DNA酶切结果电泳图，图中，1:markerDL2000,2:EcoRI,3:BamHI,4:XhoI,5:DraI,6:marker15000。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：

如图1和图2所示，以黔薏1号为原料，按如下步骤实施：

(1)将新鲜或冷冻的的薏苡叶片在液氮中充分研磨，取约100mg加入到0.8mL提取液中，涡旋彻底混匀，于65℃水浴中放置30min。